Las pantallas desplegables con pantallas CRISPR proporcionan a los investigadores un método simple, eficiente y económico para interrogar la función de la cadena a nivel de todo el genoma. La ventaja de CRISPR es su flexibilidad de editar cualquier gen simplemente cambiando la secuencia de guía. Las bibliotecas de guías CRISPR permiten a los investigadores interrogar todo el genoma de cualquier organismo en un experimento de una manera imparcial y sistemática.
Actualmente, las pantallas CRISPR se utilizan para identificar genes esenciales en cientos de cánceres humanos y para mapear interacciones genéticas. Las pantallas también pueden perfilar de forma exhaustiva los medicamentos para revelar los mecanismos de acción de los medicamentos. Las bibliotecas CRISPR descritas aquí se dirigen a las células humanas.
Sin embargo, las bibliotecas de guías dirigidas a otras especies, como el ratón, están disponibles y se pueden examinar de forma similar. Realizar pantallas de ancho del genoma en células humanas puede ser desalentador en la práctica, ya que implica el manejo de decenas de millones en células y requiere el análisis de grandes conjuntos de datos. Antes de iniciar una pantalla, asegúrese de que las líneas celulares se caracterizan cuidadosamente.
Esto incluye conocer la pureza de su línea celular, duplicar el tiempo, eficiencias de transducción de lentivirus y sensibilidad a los agentes de selección de antibióticos. Una demostración visual proporcionará una imagen de cómo manejar prácticamente los millones de células requeridas en una pantalla y realizar un seguimiento de miles de perturbaciones de manera sistemática. Demostrando el procedimiento estarán Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh y Ryan Climie, todos técnicos de mi laboratorio.
Comience transformando el plásmido CRISPR sgRNA ya hecho en células electrocompetentes y creándolos de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Cuando esté listo para cosechar las colonias, agregue siete mililitros de LB con carbenicillina a cada plato y raspe las colonias con el esparcidor celular. Utilice una pipeta de 10 mililitros para transferir las células raspadas a un matraz cónico estéril de un litro, y enjuague la placa con cinco mililitros de LB con carenicillina.
Una vez más, transfiera la solución de enjuague al matraz. Centrifugar las células de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y luego, determinar el peso del pellet húmedo. Purificar el ADN plásmido utilizando un kit de purificación de plásmido a escala Maxi o Mega.
Preparar las células para la transfección sembrando 293 células T e incubando durante la noche. Al día siguiente, preparar la mezcla de tres plásmidos de transfección para placas de 15 centímetros. Calcular la cantidad de plásmido necesaria para una transfección y hacer una mezcla de plásmidos para el número de placas, más una, para ser transfectados.
A continuación, prepare un reactivo de transfección a base de lípidos para cada transfección y medios séricos reducidos alícuotas en tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mililitros para el número de placas a transfectar. Agregue el reactivo de transfección, mezcle suavemente e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de la incubación, agregue ADN al reactivo de transfección en una proporción de tres a uno de reactivo de transfección a microgramos del complejo de ADN.
Mezclar la solución suavemente y dejar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agregue la mezcla de transfección a las células de envasado e incubarlas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. El día de la cosecha viral, compruebe las células en busca de morfología anormal y fusionada como una indicación de una buena producción de virus, y cosecha el lentivirus recogiendo el sobrenadante y transfiriéndolo a un tubo de centrífuga estéril.
Comience seleccionando la cobertura de la biblioteca de ARN de guía CRISPR que se mantendrá en toda la pantalla. Según la cobertura de la biblioteca, determine el número de células necesarias para mantenerlo por ARN guía y el número de células necesarias para la infección en MOI 0.3. A continuación, determinar el número de placas necesarias para configurar la infección y luego, cosechar y sembrar las células a cada plato.
Agregue bromuro de hexadimetrina a todas las placas y agregue el volumen de virus necesario para el cribado y controle dos placas. No agregue virus para controlar uno. Sustituya ese volumen por un medio.
Mezcle bien las placas inclinando y coloque las placas en una incubadora, asegurándose de que estén niveladas. Cosecha las células infectadas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y recoge tres réplicas de pellets celulares de las células agrupadas para la extracción del ADN genómico. Centrifugar las células a 500 g durante cinco minutos y lavarlas con PBS.
Etiquete los tubos y congele los pellets celulares a menos 80 grados centígrados. Divida el grupo de celdas infectadas en tres grupos de réplica, asegurándose de mantener la cobertura de la biblioteca dentro de cada réplica. Siembra las células en una densidad que normalmente se utilizaría al expandirlas.
Utilice el mismo número de celdas para cada réplica y el mismo número total de celdas entre réplicas. Continúe pasando las células y cosecha tres réplicas de pellets celulares de cada réplica de células infectadas agrupadas por hasta 15 a 20 duplicaciones celulares. En cada pasaje, cosecha las células de todas las placas de cada réplica.
Etiquete cada pellet con la designación de tiempo y réplica. Configurar PCR1 de acuerdo con las instrucciones del manuscrito con un total de 100 microgramos de ADN genómico a 3,5 microgramos de ADN genómico por reacción de 50 microlitros y configurar reacciones idénticas de 50 microlitros para lograr la cobertura deseada. Configure una reacción del tubo PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Utilice cinco microlitros del producto PCR1 agrupado como plantilla y utilice combinaciones de imprimación de índice únicas para cada muestra individual para permitir la agrupación de muestras de biblioteca de secuenciación. Después de completar la PCR, ejecute el producto de tubo PCR en un gel de 2% de agarosa a baja tensión durante una de una a 1 hora y media. Visualice el producto en un transilluminador de luz azul e exciba la banda de par base 200.
Purificar el ADN y medir su cantidad y calidad con un espectrofotómetro y un fluorómetro. Una biblioteca de ARN guía ideal debe tener cada ARN guía representado en cantidades similares. La secuenciación de próxima generación se puede utilizar para confirmar que la biblioteca tiene una distribución estrecha de los ARN de guía.
El análisis de recuperación de precisión se puede utilizar para evaluar el rendimiento de la pantalla. Una pantalla de alto rendimiento debe recuperar un gran número de genes esenciales a un factor base mayor que seis y una tasa de descubrimiento falso de menos del 5% La curva de recuperación de precisión debe tener un codo afilado y una línea recta al punto terminal. El factor Bayes representa una medida de confianza que el nocaut del gen resulta en un defecto de aptitud.
Las puntuaciones altas indican una mayor confianza, mientras que las puntuaciones bajas sugieren que el nocaut del gen proporciona ventajas de crecimiento. Las piscinas eliminatorias en todo el genoma se pueden cultivar en presencia de un exceso de agente farmacológico para buscar genes de resistencia supresora. Para realizar una pantalla de selección positiva para el supresor del bloque de timidina, los recuentos de lectura normalizados para todos los ARN guías en T0 se trazan contra recuentos de lectura normalizados medios para muestras tratadas con timidina.
Un detalle clave para realizar con éxito las pantallas CRISPR es mantener una buena distribución de cada ARN guía, desde la transfección del plásmido hasta la transducción de células. Esto minimizará la posibilidad de efectos aleatorios que pueden sesgar la representación del ARN guía y conducir a resultados falsos positivos o negativos. Después de una validación de pantalla, se deben realizar experimentos para confirmar los hits porque la pantalla principal solo identifica los posibles hits.
Dependiendo de la biología de los hits, se pueden utilizar varios métodos. La edición CRISPR, combinada con la secuenciación de próxima generación, ha permitido la pérdida de pantallas de funciones a escala del genoma en diversos sistemas de modelos humanos. Debido a la simplicidad de CRISPR, este tipo de pantallas son ahora ampliamente accesibles para todos los investigadores, lo que permite a más científicos utilizar métodos genéticos funcionales para estudiar los procesos biológicos y la enfermedad.
