Este protocolo es significativo porque es un excelente modelo para estudiar la inflamación corneal y su contribución a la cicatrización de heridas en condiciones normales y patológicas. La principal ventaja de esta técnica es que crea una herida epitelial precisa y reproducible sin romper la membrana basal. Este modelo de heridas corneales es sencillo y rápido de realizar.
Demostrando el procedimiento estará el Príncipe Akowuah, un estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, prepare una solución de fluoresceína al 1% disolviendo 10 miligramos de sal de fluoresceína de sodio en un mililitro de solución salina estéril o PBS. A continuación, para la anestesia, prepare 10 mililitros de un cóctel de ketamina-xilazina mezclando dos mililitros de ketamina, un mililitro de xilazina y siete mililitros de PBS estéril.
Después de anestesiar a un ratón C57 negro 6 de 8 a 12 semanas de edad, evalúe la profundidad de la anestesia evaluando el reflejo del pedal después del pellizco del dedo del pie. Para crear la herida corneal epitelial, coloque el ratón anestesiado bajo un microscopio de disección. Enrolle solo el ojo derecho o izquierdo y mantenga la consistencia con el ojo herido cuando se mueve del ratón al ratón.
Mantenga el ojo bien abierto sosteniendo los párpados con el pulgar y el dedo índice. Luego, usando una trefina estéril de dos milímetros de diámetro, demarque el centro de la córnea y gire suavemente la trefina para causar una impresión en el epitelio corneal. No aplique presión excesiva, ya que esto puede resultar en perforación corneal.
A continuación, sosteniendo el palo de golf romo estéril en un ángulo de aproximadamente 45 grados desde la superficie de la córnea, desbridar el epitelio mediante un raspado cuidadoso y continuo dentro del área demarcada utilizando el spud. No aplique fuerza excesiva y mantenga la hidratación usando PBS estéril si es necesario. Para monitorear el cierre de la herida y la reepitelización, pipetee de 1 a 1.5 microlitros de solución de fluoresceína al 1% en la superficie herida y tome imágenes de la córnea con un microscopio digital con una fuente de luz azul.
Imagine la córnea herida en momentos específicos después de la herida. Tome imágenes dentro del primer minuto de la adición de solución de fluoresceína para evitar la propagación de la solución al epitelio circundante, lo que puede llevar a una sobreestimación del tamaño de la herida. A continuación, utilizando un software de análisis de imágenes, rastree el área de la herida y exprese el área de la herida en cada punto de tiempo como un porcentaje del área original de la herida a la hora cero.
Una micrografía electrónica de transmisión de la herida corneal demuestra que la membrana basal del epitelio permanece intacta incluso después de la lesión. En ratones salvajes de 8 a 12 semanas de edad, el cierre de la herida se completa 24 horas después de la herida. La respuesta inflamatoria a la herida se caracteriza por imágenes celulares en el limbo.
Aquí se muestra la vasculatura limbal de una córnea no enrollada con neutrófilos extravasculares, y la de una córnea herida con plaquetas extravasculares y neutrófilos 30 horas después de la abrasión. Para reproducir con éxito este protocolo, se debe usar la misma cepa en cada rango de ratón, y se debe crear el tamaño y la profundidad de la herida como se describe.
