Los protocolos para el cultivo de organoides hepáticos e intestinales caninos son importantes para estandarizar esta novedosa tecnología. Esta técnica permite el establecimiento fiable y reproducible del cultivo de organoides caninos incluyendo el aislamiento de organoides, mantenimiento, recolección y posterior biobanco de muestras. Los organoides caninos pueden proporcionar un excelente modelo para numerosas aplicaciones que abarcan desde la biología, el desarrollo de enfermedades infecciosas, las pruebas y el descubrimiento de fármacos, y también la medicina de transmisión.
Para comenzar, prepare cinco tubos centrífugos de 15 mililitros con cinco mililitros de solución quelante completa 1X, un tubo con tres mililitros de solución quelante completa 1X, un tubo vacío y un tubo con cinco mililitros de solución quelante completa 1X y dos mililitros de suero bovino fetal. El día del aislamiento, coloque una placa de Petri estéril, un bisturí, un cubo de hielo y una mezcla de nutrientes DMEM avanzada fría F12 en el gabinete de bioseguridad. Coloque el número requerido de placa de cultivo celular de 24 pocillos en la incubadora de dióxido de carbono para precalentarse.
Coloque la matriz de membrana extracelular solubilizada sobre hielo para descongelar. Pre-enfriar la centrífuga a cuatro grados centígrados. Mueva los medios completos con factores de crecimiento del congelador a un baño de agua de 37 grados Celsius evitando la exposición directa a la luz.
Agite las muestras de tejido en el tubo de transporte durante 30 segundos. Retire el sobrenadante excesivo sin desechar ningún tejido mediante pipeteo lento cerca de la superficie del fluido hasta que queden 0,5 mililitros en el tubo. Transfiera el tejido y el sobrenadante restante a una placa de Petri estéril.
Usando un bisturí desechable, corte y pica el tejido en trozos más pequeños que se asemejen a una consistencia de puré durante aproximadamente cinco minutos. Pipetee el tejido picado con líquido de la placa de Petri al primer tubo de solución quelante completo, luego agregue dos mililitros de mezcla avanzada de nutrientes DMEM F12 a la placa de Petri. Enjuague el tejido restante y transfiéralo al primer tubo de solución quelante completa.
Vórtice el tubo de solución quelante completa 1X aproximadamente cinco veces durante cinco segundos. Permita que las biopsias se asienten en la parte inferior del tubo durante un minuto y retire el sobrenadante hasta que queden cinco mililitros. Transfiera la solución quelante completa 1X del tubo nuevo al tubo de muestra.
Repita el paso anterior para los dos tubos siguientes. Y en los dos últimos lavados, retire el sobrenadante hasta tres mililitros que queden en el tubo. Transfiera las biopsias y la solución quelante completa 1X del tubo de muestra a un pocillo de una placa de seis pocillos.
Agregue tres mililitros de solución quelante completa 1X al tubo de muestra. Gire suavemente para recoger cualquier tejido restante y transfiéralo al mismo pozo de la placa. Agregue 150 microlitros de ácido tetraacético de etileno diamina 0.5 molares en un pozo y coloque la placa de seis pocillos en un balancín de 20 grados a 24 RPM a cuatro grados Celsius.
Incubar las muestras de hígado durante 10 minutos y las muestras intestinales durante una hora en el balancín en movimiento. Transporte la placa de seis pocillos de vuelta al gabinete de bioseguridad y transfiera el tejido picado y el líquido a un tubo que contiene 1X solución quelante completa con suero fetal bovino. Permita que los tejidos se asienten y transporte el sobrenadante con 0,2 mililitros de la parte superior del tejido a un tubo vacío.
Gire hacia abajo el tubo que contiene la muestra a 700 XG durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Las células madre ahora se peletizan junto con el tejido picado. Retire y deseche el sobrenadante con cuidado para no molestar el pellet.
Resuspend el pellet en DMEM F12 avanzado. Gire el tubo de nuevo y aspire el sobrenadante sin molestar el pellet. Agregue el volumen calculado de matriz de membrana extracelular solubilizada al tubo de muestra.
Tenga cuidado al retirar los medios para no perder el pellet celular. Al agregar una matriz de membrana extracelular, pipetee lentamente para no crear burbujas excesivas en la suspensión organoide. Mantenga la muestra con la matriz de membrana extracelular solubilizada sobre hielo y siembre la suspensión en el medio de los pocillos para que la matriz de membrana extracelular solubilizada forme una estructura en forma de cúpula.
Transporta la placa a una incubadora y deja que la matriz de membrana extracelular solubilizada se solidifique durante 30 minutos. Mezcle el inhibidor de ROCK y GSK3 beta en medios completos con factores de crecimiento y agregue 500 microlitros de esta solución a cada pocillo. Coloque la placa en la incubadora.
El protocolo organoide canino generalmente genera aproximadamente 50, 000 a 150, 000 células intestinales o hepáticas por pozo. Después del aislamiento de células madre, los organoides caninos hepáticos comienzan su ciclo de vida como esferoides en expansión, y después de siete días, se convierten en organoides en ciernes y diferenciadores. Se calculó el volumen, el área de superficie, el área de elipse 2D y la circunferencia de los esferoides.
Se utilizó el área de elipse 2D y la circunferencia para evaluar la salud del cultivo de organoides. La evaluación de la expresión de los marcadores de manera semicuantitativa mostró que los esferoides expresaron preferentemente el marcador de colangiocitos KRT7 variando de uno a 26%La expresión del marcador de células madre LGR5 osciló entre 0,17 y 0,78%, mientras que los marcadores de hepatocitos se expresaron en menor medida en 0,05 a 0,34% para forkhead box 1A y 0,03 a 0,28% para citocromo-P450. Una incubación de 12 minutos con proteasa similar a la tripsina no inhibió el crecimiento de organoides.
Sin embargo, el crecimiento de los organoides se vio afectado negativamente mediante una incubación de 24 minutos. Se analizó la capacidad de supervivencia de los organoides hepáticos caninos en un ambiente desfavorable para determinar el volumen de medios organoides y la matriz del sótano necesarios para el crecimiento y la supervivencia exitosos de los organoides hepáticos. La tasa de supervivencia de los organoides varió de 12,9 días a 18 días.
Las técnicas básicas de cultivo celular y los enfoques asépticos son los requisitos previos esenciales para el aislamiento y mantenimiento adecuado de los organoides.
