Este protocolo es el primer protocolo completo de ablación con láser en embriones tempranos de algas marinas. El procedimiento ofrece un enfoque confiable para investigar el destino celular y la interacción durante la embriogénesis en algas pardas. La ablación celular local con láser permite la ablación temporal y especial con un alto nivel de precisión y tejido en las células.
Este enfoque es un método prometedor para estudiar los destinos celulares y la interacción en el embrión temprano de algas pardas. Se puede aplicar a otros sistemas de algas con pocos cambios. Comience por obtener imágenes de toda la placa de Petri para localizar los embriones para su selección durante la etapa de ablación y supervise el desarrollo posterior de los embriones seleccionados.
Inicie el análisis de mosaicos. Registre la posición de los cuatro puntos cardinales de la placa de Petri. Introduzca los parámetros definidos en el manuscrito de texto y adquiera imágenes transmitidas o fluorescentes de toda la placa de Petri a baja resolución.
Guarde la imagen de escaneo de mosaico y manténgala abierta en la ventana del software de adquisición de imágenes. Cambia el objetivo sin quitar la placa de Petri. Encuentre embriones de interés en la exploración.
Para calibrar el láser, abra el controlador láser y el paquete de software de adquisición de imágenes. A continuación, inicialice la ruta del láser. Sincronice ambos paquetes de software haciendo clic en iniciar adquisición en el paquete de software del controlador láser.
Configure los parámetros para la ablación con láser y haga clic en en vivo. Seleccione un área vacía en el plato y baje el nivel del escenario a 20 micrómetros por debajo de la superficie superior de la placa de Petri para centrarse en el fondo de vidrio. Para encontrar un área de interés haciendo clic en el botón elija AOI y haga clic en los bordes de la imagen en el paquete de software del controlador láser UV.
Haga clic en iniciar calibración y seleccione calibración manual para establecer las trayectorias del láser de ablación y del láser de imágenes. Asegúrese de que todas las persianas estén abiertas. Seleccione una potencia láser lo suficientemente alta como para ver un punto negro en el centro de la imagen en vivo correspondiente al orificio en el deslizamiento de la cubierta de vidrio.
Haga clic en el punto negro central con el cursor del mouse y seleccione 18 puntos adicionales propuestos por el software para completar el procedimiento de alineación. Haga clic en el modo de clic y disparo. Verifique la calibración en el mismo deslizamiento de la cubierta y haga clic en la capa de vidrio donde el impacto del láser es visible.
Seleccione un embrión de interés en el escaneo de mosaico y mueva el escenario haciendo clic en él. Inicie la serie temporal. Pruebe los parámetros de lapso de tiempo en vivo y ajuste si es necesario.
Inicie una grabación de lapso de tiempo en el software de adquisición de imágenes a la velocidad máxima. Ajuste el zoom para enfocar el área de interés y visualizar todo el embrión. Para seguir al embrión durante el registro de la ablación, haga clic en el botón, adquiera la última imagen.
Ajuste los parámetros al 45% de transmisión láser correspondiente a un máximo de 40 microvatios y una duración de tiempo de pulso de milisegundos. Aplique la irradiación dañina en las células embrionarias de interés utilizando el software del controlador láser click and fire function. Bajo 688 nanómetros, monitoree la eyección de cloroplastos autofluorescentes del citoplasma.
Si el contenido de la celda permanece en la celda, utilice la función de clic y disparo una vez más para aumentar el tamaño de la brecha en la celda. Repita este proceso hasta que se libere la mayor parte del contenido de la celda, manteniendo el número de disparos al mínimo. Detenga el registro del lapso de tiempo después de que el embrión se haya estabilizado y no se pueda detectar ningún movimiento intercelular adicional.
Actualice la anotación en la imagen de escaneo de mosaico, sobrescriba el escaneo de mosaico existente y guarde la imagen. Determine la tasa de supervivencia monitoreando el número de embriones que se desarrollan después de la ablación con láser y compárelos con los que mueren. Determine el retraso en el crecimiento midiendo la longitud de los embriones inyectados con láser todos los días y comparándola con embriones intactos.
Encuentre el daño adyacente monitoreando la reacción de las células adyacentes a las células ablacionadas. Las células objetivo de interés fueron la célula más apical, la célula más basal y las células medianas. Después de escanear toda la placa de Petri, se identificó un embrión de interés como un candidato adecuado para el disparo con láser.
La célula liberó su contenido cuando se disparó con un rayo láser UV de pulso a una potencia del 45%, mientras que la célula adyacente a las células irradiadas se expandió al espacio intercelular. La posición de los embriones irradiados se registró cada 24 horas durante 10 días. La mayoría de los embriones irradiados continuaron desarrollándose, pero mostraron alteración del crecimiento.
En contraste, los embriones probados con otros parámetros del láser mostraron rápidamente signos de estrés severo, como blanqueamiento celular, desvanecimiento o cambios de forma. Casi todos los embriones disparados de esta manera murieron dentro de los cinco días posteriores al experimento. Algunos parámetros, como el formato de imagen o el zoom, no deben cambiarse después de la calibración.
Se requiere monitoreo durante y después de la ablación con láser para tener una idea de lo que sucedió. La ablación con láser está allanando el camino hacia nuevos descubrimientos en el estudio del desarrollo de las algas pardas y una comprensión más profunda de las interacciones de diferentes metabolitos o componentes de sus células.
