Los ensayos de potencial de membrana basados en fluorescencia proporcionan métodos robustos para estudiar los efectos de los moduladores en los canales iónicos que se expresan endógenamente en las células epiteliales. Como prueba de concepto, estamos midiendo la función de dos canales iónicos en líneas celulares epiteliales bien conocidas. Este ensayo es versátil, ya que utiliza una sonda química exógena para medir la función del canal iónico, evitando así la necesidad de sondas codificadas genéticamente.
Estos ensayos de alto rendimiento pueden identificar y caracterizar los efectos de los moduladores de moléculas pequeñas en los canales iónicos, que tienen el potencial de avanzar en las terapias para la fibrosis quística. Para empezar, cultivar células Calu-3 y Caco-2 en un matraz T75 que contenga EMEM con 20% de suero bovino fetal y estreptomicina al 1% de penicilina. Aspirar el medio del matraz T75 después de que las células alcancen 80 a 100% de confluencia.
Lave suavemente las células con 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Luego, agregue 2 mililitros de tripsina al 0,25% precalentada, con 0,1% de EDTA, a la monocapa celular. Colocar el matraz a 37 grados centígrados durante aproximadamente cinco minutos.
En este paso, asegúrese de que las células se levanten de la superficie del matraz y se disocien en la suspensión de una sola célula. Agregue 8 mililitros de medio de cultivo para neutralizar la reacción. Cuando las células alcancen 30 a 40% de confluencia, agregue 1.5 mililitros de la suspensión celular a 18.5 mililitros de medio de cultivo en un tubo cónico y mezcle.
Agregue 200 microlitros de esta suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos para obtener aproximadamente 140, 000 células por pozo. Para colocar una placa completa de 384 pocillos, agregue 1 mililitro de la suspensión celular a 17 mililitros del medio de cultivo en un tubo cónico para obtener aproximadamente 50, 000 células por pocillo. Después de mezclar, agregue 50 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo.
Cambie el medio cada dos días y asegúrese de que las células alcancen el 100% de confluencia dentro de tres a cinco días en todos los pocillos simultáneamente. Cambiar el medio 24 horas previas a los estudios funcionales. Primero, prepare la solución tampón libre de sodio y cloruro con los reactivos enumerados en el protocolo de texto.
Agregue los reactivos al agua de doble destilación de grado de cultivo de tejidos. Deje que los reactivos se disuelvan agitando durante la noche a temperatura ambiente. Después de que la solución esté estable, ajuste el pH a 7.4 agregando 1 solución NMDG molar gota a gota.
Mezcle durante 30 minutos y ajuste la osmolaridad de la solución a un rango de 300 más o menos 5 milimoles por kilogramo. Filtrar y almacenar la solución tampón en frascos estériles. Luego, disuelva 0.5 miligramos del colorante de potencial de membrana en 1 mililitro de tampón libre de sodio y cloruro y caliente la solución a 37 grados centígrados.
Retire el medio de cultivo de las monocapas celulares Calu-3 y Caco-2. Agregue 195 microlitros de la solución de colorante por pocillo para la placa de 96 pocillos y 95 microlitros por pocillo para una placa de 384 pocillos. Permita que las células carguen el tinte durante 35 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Luego, tome medidas de fluorescencia con excitación a 530 nanómetros y emisión a 560 nanómetros. Inicialmente, tome lecturas de referencia continuas durante cinco minutos a intervalos de 30 segundos. Luego, agregue 5 microlitros de solución de forskoline de 400 micromoles a cada pocillo de la placa de 96 pocillos, para obtener una concentración final de forskoline de un micromolar.
Para la placa de 384 pocillos, agregue cinco microlitros de solución de forskolina de 20 micromoles. Tome una calificación de estimulación durante 20 minutos con mediciones a intervalos de 15 segundos. A continuación, agregue 5 microlitros de una solución de 400 micromolares de inhibidor de CFTR a la placa de 96 pocillos, para obtener una concentración final de 10 micromolares.
A la placa de 384 pocillos, agregue 5 microlitros de inhibidor de CFTR micromolar 200. Tome una lectura de inhibición durante 15 minutos con mediciones a intervalos de 30 segundos. Cuantifique las mediciones de intensidad de fluorescencia de cada pozo y exporte los valores como una hoja de cálculo.
en formato de columna, que contiene pozos individuales. Para calcular los cambios inducidos por forskolina, divida las medidas de la unidad de fluorescencia relativa de cada pocillo de la placa de 96 pocillos por la última medición de intensidad de fluorescencia de la lectura de referencia y tráquelas. Mida las respuestas máximas como la intensidad máxima de fluorescencia medida desde el inicio durante la estimulación de forskolina.
Utilice esta medición, o área bajo la curva, para cuantificar la respuesta CFTR. La función CFTR se detectó como despolarización de membrana después de la estimulación de forskoline en células Caco-2. El flujo de fluoruro se detectó como un fuerte aumento de la fluorescencia en comparación con el DMSO como control del vehículo.
Después de la estimulación con forskolina, la señal fluorescente se mantuvo hasta la adición del inhibidor de CFTR, después de lo cual hubo una rápida disminución en la intensidad de la fluorescencia. Este fenómeno fue reproducible tanto en células Caco-2 como en células Calu-3. La actividad de CFTR se calculó como la diferencia en el cambio máximo en la fluorescencia después de la estimulación con forskoline o DMSO.
Los puntos individuales variaron entre más o menos 3 desviaciones estándar de la media en el caso de la estimulación con forskoline y el control DMSO, lo que indica la reproducibilidad del ensayo. Para confirmar la especificidad de las respuestas funcionales, estos ensayos de potencial de membrana pueden validarse aún más utilizando métodos electrofisiológicos convencionales, como la cámara de Ussing. Esta plataforma es capaz de cerrar la brecha entre las pantallas moduladoras de alto rendimiento y los sistemas de expresión heterólogos y las mediciones bioeléctricas que consumen mucho tiempo en tejidos primarios de difícil acceso.
