Анализы мембранного потенциала на основе флуоресценции обеспечивают надежные методы изучения воздействия модуляторов на ионные каналы, которые эндогенно экспрессируются в эпителиальных клетках. В качестве доказательства концепции мы измеряем функцию двух ионных каналов в хорошо известных линиях эпителиальных клеток. Этот анализ является универсальным, поскольку он использует экзогенный химический зонд для измерения функции ионных каналов, что позволяет избежать необходимости в генетически кодируемых зондах.
Эти высокопроизводительные анализы могут идентифицировать и характеризовать влияние низкомолекулярных модуляторов на ионные каналы, которые могут способствовать развитию методов лечения муковисцидоза. Для начала культивируют клетки Calu-3 и Caco-2 в колбе T75, содержащей EMEM с 20% эмбриональной бычьей сывороткой и 1% пенициллиновым стрептомицином. Аспирируйте среду из колбы T75 после того, как ячейки достигнут слияния от 80 до 100%.
Аккуратно промойте клетки 10 миллилитрами фосфатно-буферного физиологического раствора. Затем добавьте 2 миллилитра предварительно подогретого 0,25% трипсина с 0,1% ЭДТА в монослой клетки. Поставьте колбу при температуре 37 градусов Цельсия примерно на пять минут.
На этом этапе убедитесь, что клетки отрываются от поверхности колбы и диссоциируют в одноклеточную суспензию. Добавьте 8 миллилитров питательной среды, чтобы нейтрализовать реакцию. Когда клетки достигнут слияния от 30 до 40%, добавьте 1,5 миллилитра клеточной суспензии к 18,5 миллилитрам питательной среды в конической пробирке и перемешайте.
Добавьте 200 микролитров этой клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночной пластины, чтобы получить примерно 140 000 клеток на лунку. Чтобы установить одну полную 384-луночную пластину, добавьте 1 миллилитр клеточной суспензии к 17 миллилитрам питательной среды в конической трубке, чтобы получить примерно 50 000 клеток в лунке. После перемешивания добавьте в каждую лунку по 50 микролитров клеточной суспензии.
Меняйте среду каждые два дня и следите за тем, чтобы клетки достигали 100% слияния в течение трех-пяти дней во всех лунках одновременно. Смените носитель за 24 часа до начала функциональных исследований. Во-первых, приготовьте буферный раствор без натрия и хлоридов с реагентами, перечисленными в текстовом протоколе.
Добавьте реагенты в тканевую культуральную воду двойной дистилляции. Дайте реагентам раствориться, помешивая в течение ночи при комнатной температуре. После того, как раствор станет стабильным, отрегулируйте рН до 7,4, добавив 1 молярный раствор NMDG по каплям.
Перемешивайте в течение 30 минут и отрегулируйте осмолярность раствора в диапазоне 300 плюс-минус 5 миллимолей на килограмм. Буферный раствор фильтруют и хранят в стерильных флаконах. Затем растворите 0,5 миллиграмма мембранного потенциального красителя в 1 миллилитре буфера, не содержащего натрия и хлоридов, и нагрейте раствор до 37 градусов по Цельсию.
Удалите питательную среду из монослоев клеток Calu-3 и Caco-2. Добавьте 195 микролитров раствора красителя на лунку для 96-луночной пластины и 95 микролитров на лунку для 384-луночной пластины. Дайте клеткам загрузить краситель в течение 35 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Затем проводят измерения флуоресценции с возбуждением при 530 нанометрах и излучением при 560 нанометрах. Сначала снимайте непрерывные базовые показания в течение пяти минут с 30-секундными интервалами. Затем добавьте 5 микролитров 400-микромолярного раствора Forskolin в каждую лунку 96-луночной пластины, чтобы получить окончательную концентрацию Forskolin в один микромоляр.
Для 384-луночной пластины добавьте пять микролитров 20-микромолярного раствора форсколина. Возьмите рейтинг стимуляции в течение 20 минут с измерениями с 15-секундными интервалами. Затем добавьте 5 микролитров 400-микромолярного раствора ингибитора CFTR в 96-луночную пластину, чтобы получить конечную концентрацию 10 мкмоль.
К 384-луночной пластине добавьте 5 микролитров 200-микромолярного ингибитора CFTR. Снимайте показания торможения в течение 15 минут с измерениями с 30-секундными интервалами. Количественно оцените измерения интенсивности флуоресценции каждой лунки и экспортируйте значения в виде электронной таблицы.
в формате столбца, содержащего отдельные лунки. Чтобы рассчитать изменения, индуцированные форсколином, разделите измерения относительных единиц флуоресценции из каждой лунки 96-луночной пластины на последнее измерение интенсивности флуоресценции базовых показаний и нанесите их на график. Измерьте пиковые реакции как максимальную интенсивность флуоресценции, измеренную от исходного уровня во время стимуляции форсколином.
Используйте это измерение или площадь под кривой для количественной оценки отклика CFTR. Функция CFTR была определена как деполяризация мембраны после стимуляции форсколином в клетках Caco-2. Отток фтора был обнаружен как резкое увеличение флуоресценции по сравнению с ДМСО в качестве контроля транспортного средства.
После стимуляции форсколином флуоресцентный сигнал поддерживался до добавления ингибитора CFTR, после чего происходило быстрое снижение интенсивности флуоресценции. Это явление было воспроизводимо как в клетках Caco-2, так и в клетках Calu-3. Активность CFTR рассчитывали как разницу в максимальном изменении флуоресценции после стимуляции форсколином или ДМСО.
Отдельные точки варьировались между плюс-минус 3 стандартными отклонениями от среднего значения в случае стимуляции форсколином и контроля ДМСО, что указывает на воспроизводимость анализа. Чтобы подтвердить специфичность функциональных реакций, эти анализы мембранного потенциала могут быть дополнительно проверены с использованием традиционных электрофизиологических методов, таких как камера Уссинга. Эта платформа способна преодолеть разрыв между высокопроизводительными экранами модуляторов и гетерологичными системами экспрессии и трудоемкими биоэлектрическими измерениями в труднодоступных первичных тканях.
