Les tests de potentiel membranaire basés sur la fluorescence fournissent des méthodes robustes pour étudier les effets des modulateurs sur les canaux ioniques qui sont exprimés de manière endogène dans les cellules épithéliales. Comme preuve de concept, nous mesurons la fonction de deux canaux ioniques dans des lignées cellulaires épithéliales bien connues. Ce test est polyvalent, car il utilise une sonde chimique exogène pour mesurer la fonction des canaux ioniques, évitant ainsi le besoin de sondes génétiquement codées.
Ces tests à haut débit peuvent identifier et caractériser les effets des modulateurs de petites molécules sur les canaux ioniques, qui ont le potentiel de faire progresser les thérapies pour la fibrose kystique. Pour commencer, cultiver les cellules Calu-3 et Caco-2 dans une fiole T75 contenant EMEM avec 20% de sérum bovin fœtal et 1% de streptomycine pénicilline. Aspirer le milieu du ballon T75 après que les cellules ont atteint 80 à 100% de confluence.
Lavez délicatement les cellules avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de trypsine 0,25% préchauffée, avec 0,1% d’EDTA, à la monocouche cellulaire. Placer la fiole à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes.
Dans cette étape, s’assurer que les cellules se soulèvent de la surface du ballon et se dissocient en suspension unicellulaire. Ajouter 8 millilitres de milieu de culture pour neutraliser la réaction. Lorsque les cellules atteignent 30 à 40% de confluence, ajoutez 1,5 millilitre de suspension cellulaire à 18,5 millilitres de milieu de culture dans un tube conique et mélangez.
Ajoutez 200 microlitres de cette suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de 96 puits pour obtenir environ 140 000 cellules par puits. Pour plaquer une plaque complète de 384 puits, ajoutez 1 millilitre de suspension cellulaire à 17 millilitres du milieu de culture dans un tube conique pour obtenir environ 50 000 cellules par puits. Après mélange, ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire à chaque puits.
Changez le milieu tous les deux jours et assurez-vous que les cellules atteignent 100% de confluence dans les trois à cinq jours dans tous les puits simultanément. Changez le milieu 24 heures avant les études fonctionnelles. Tout d’abord, préparez la solution tampon sans sodium et sans chlorure avec les réactifs énumérés dans le protocole texte.
Ajouter les réactifs à de l’eau bidistillée de qualité tissulaire. Laisser les réactifs se dissoudre en agitant pendant une nuit à température ambiante. Une fois la solution stable, ajuster le pH à 7,4 en ajoutant 1 molaire de solution NMDG goutte à goutte.
Mélanger pendant 30 minutes et ajuster l’osmolarité de la solution à une plage de plus ou moins 5 millimoles par kilogramme. Filtrer et conserver la solution tampon dans des flacons stériles. Ensuite, dissoudre 0,5 milligramme du colorant potentiel membranaire dans 1 millilitre de tampon sans sodium et sans chlorure et réchauffer la solution à 37 degrés Celsius.
Retirer le milieu de culture des monocouches cellulaires Calu-3 et Caco-2. Ajouter 195 microlitres de solution de colorant par puits pour la plaque de 96 puits, et 95 microlitres par puits pour une plaque de 384 puits. Laissez les cellules charger le colorant pendant 35 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Ensuite, prenez des mesures de fluorescence avec excitation à 530 nanomètres et émission à 560 nanomètres. Dans un premier temps, prenez des lectures de base continues pendant cinq minutes à intervalles de 30 secondes. Ensuite, ajoutez 5 microlitres de solution de forskoline 400 micromolaires à chaque puits de la plaque de 96 puits, pour obtenir une concentration finale de forskoline d’une micromolaire.
Pour la plaque de 384 puits, ajoutez cinq microlitres de solution de forskoline à 20 micromolaires. Prenez un indice de stimulation pendant 20 minutes avec des mesures à intervalles de 15 secondes. Ensuite, ajoutez 5 microlitres d’une solution 400 micromolaires d’inhibiteur du CFTR à la plaque de 96 puits, pour obtenir une concentration finale de 10 micromolaires.
À la plaque de 384 puits, ajoutez 5 microlitres d’inhibiteur de CFTR à 200 micromolaires. Prenez une lecture d’inhibition pendant 15 minutes avec des mesures à intervalles de 30 secondes. Quantifier les mesures d’intensité de fluorescence de chaque puits et exporter les valeurs sous forme de feuille de calcul.
sous forme de colonne, contenant des puits individuels. Pour calculer les changements induits par la forskoline, divisez les mesures relatives de l’unité de fluorescence de chaque puits de la plaque de 96 puits par la dernière mesure de l’intensité de fluorescence de la lecture de base et tracez-les. Mesurer les réponses maximales comme l’intensité de fluorescence maximale mesurée à partir de la ligne de base pendant la stimulation de la forskoline.
Utilisez cette mesure, ou l’aire sous la courbe, pour quantifier la réponse CFTR. La fonction CFTR a été détectée comme une dépolarisation de la membrane après stimulation de la forskoline dans les cellules Caco-2. L’efflux de fluorure a été détecté comme une forte augmentation de la fluorescence par rapport au DMSO comme commande du véhicule.
Après la stimulation de la forskoline, le signal fluorescent a été maintenu jusqu’à l’ajout de l’inhibiteur CFTR, après quoi il y a eu une baisse rapide de l’intensité de fluorescence. Ce phénomène était reproductible dans les cellules Caco-2 et Calu-3. L’activité CFTR a été calculée comme la différence dans le changement maximal de fluorescence après la stimulation de la forskoline ou du DMSO.
Les points individuels variaient entre plus ou moins 3 écarts-types de la moyenne dans le cas de la stimulation de la forskoline et du contrôle DMSO, indiquant la reproductibilité du test. Pour confirmer la spécificité des réponses fonctionnelles, ces essais de potentiel membranaire peuvent être validés à l’aide de méthodes électrophysiologiques conventionnelles, telles que la chambre d’Ussing. Cette plate-forme est capable de combler le fossé entre les cribles modulateurs à haut débit et les systèmes d’expression hétérologues et les mesures bioélectriques fastidieuses dans les tissus primaires difficiles d’accès.
