형광 기반 막 전위 분석은 상피 세포에서 내인성으로 발현되는 이온 채널에 대한 조절제의 효과를 연구하기 위한 강력한 방법을 제공합니다. 개념 증명으로, 우리는 잘 알려진 상피 세포주에서 두 이온 채널의 기능을 측정하고 있습니다. 이 분석은 이온 채널 기능을 측정하기 위해 외인성 화학 프로브를 사용하므로 유전적으로 인코딩된 프로브의 필요성을 우회하기 때문에 다재다능합니다.
이러한 고처리량 분석은 낭포성 섬유증 치료법을 발전시킬 수 있는 잠재력이 있는 이온 채널에 대한 소분자 조절제의 효과를 식별하고 특성화할 수 있습니다. 시작하려면 20% 소 태아 혈청과 1% 페니실린 스트렙토마이신이 포함된 EMEM이 포함된 T75 플라스크에서 Calu-3 및 Caco-2 세포를 배양합니다. 세포가 80%에서 100% 밀도에 도달한 후 T75 플라스크에서 배지를 흡인합니다.
10 밀리리터의 인산염 완충 식염수로 세포를 부드럽게 씻으십시오. 그런 다음 2 밀리리터의 예열 된 0.25 % 트립신과 0.1 % EDTA를 세포 단층에 첨가합니다. 플라스크를 섭씨 37도에서 약 5분 동안 놓습니다.
이 단계에서는 세포가 플라스크 표면에서 들어 올려 단일 세포 현탁액으로 해리되는지 확인합니다. 반응을 중화시키기 위해 8 밀리리터의 배양 배지를 첨가한다. 세포가 30 내지 40%confluency에 도달할 때, 원뿔형 튜브에 있는 배양 배지의 18.5 밀리리터에 세포 현탁액의 1.5 밀리리터를 첨가하고 혼합한다.
이 세포 현탁액 200 마이크로 리터를 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 웰 당 약 140, 000 개의 세포를 얻는다. 하나의 전체 384 웰 플레이트를 플레이트하려면 원추형 튜브의 배양 배지 17 밀리리터에 세포 현탁액 1 밀리리터를 추가하여 웰 당 약 50, 000 개의 세포를 얻습니다. 혼합 후, 50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 각 웰에 첨가한다.
2일마다 배지를 교체하고 모든 웰에서 동시에 3-5일 이내에 세포가 100% 밀도에 도달하는지 확인합니다. 기능 연구 24시간 전에 배지를 교체하십시오. 먼저, 텍스트 프로토콜에 나열된 시약으로 나트륨이 없고 염화물이 없는 완충 용액을 준비합니다.
조직 배양 등급의 이중 증류수에 시약을 추가합니다. 시약이 실온에서 밤새 교반하여 용해되도록 합니다. 용액이 안정되면 NMDG 용액 1몰을 적가하여 pH를 7.4로 조정합니다.
30 분 동안 혼합하고 용액의 삼투압을 킬로그램 당 300 플러스 또는 마이너스 5 밀리몰 범위로 조정하십시오. 완충 용액을 여과하고 멸균 병에 보관하십시오. 그런 다음 0.5 밀리그램의 멤브레인 포텐셜 염료를 1 밀리리터의 나트륨과 무 염화물 완충액에 녹이고 용액을 섭씨 37도까지 데우십시오.
Calu-3 및 Caco-2 세포 단층에서 배양 배지를 제거합니다. 96웰 플레이트의 경우 웰당 195마이크로리터의 염료 용액을 추가하고, 384웰 플레이트의 경우 웰당 95마이크로리터를 추가합니다. 세포가 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 35분 동안 염료를 로드하도록 합니다.
그런 다음 530 나노 미터에서 여기를, 560 나노 미터에서 방출하여 형광을 측정합니다. 처음에는 30초 간격으로 5분 동안 연속적인 기준선 판독값을 수행합니다. 그런 다음 5 마이크로 리터의 400 마이크로 몰 포스 콜린 용액을 96 웰 플레이트의 각 웰에 추가하여 1 마이크로 몰의 최종 포스 콜린 농도를 얻습니다.
384 웰 플레이트의 경우, 5 마이크로 리터의 20 마이크로 몰 포스 콜린 용액을 첨가한다. 15초 간격으로 측정하여 20분 동안 자극 등급을 측정합니다. 다음으로, 5 마이크로리터의 CFTR 억제제 용액 400 마이크로리터를 96-웰 플레이트에 첨가하여, 10 마이크로몰의 최종 농도를 얻는다.
384 웰 플레이트에 5 마이크로 리터의 200 마이크로 몰 CFTR 억제제를 첨가하십시오. 15초 간격으로 측정하여 30분 동안 억제 판독값을 측정합니다. 각 웰의 형광 강도 측정값을 정량화하고 값을 스프레드시트로 내보냅니다.
개별 웰을 포함하는 컬럼 형식입니다. 포스콜린에 의해 유도된 변화를 계산하려면 96웰 플레이트의 각 웰에서 측정된 상대적 형광 단위 측정값을 기준선 판독값의 마지막 형광 강도 측정값으로 나누고 플로팅합니다. Forskolin 자극 동안 기준선에서 측정된 최대 형광 강도로 피크 반응을 측정합니다.
이 측정값 또는 곡선 아래 면적을 사용하여 CFTR 반응을 정량화합니다. CFTR 기능은 Caco-2 세포에서 포스콜린 자극 후 막 탈분극으로 검출되었습니다. 불소 유출은 비히클 대조군으로서 DMSO에 비해 형광의 급격한 증가로서 검출되었다.
포스콜린 자극 후, CFTR 억제제를 첨가할 때까지 형광 신호가 지속되었고, 그 후 형광 강도가 급격히 감소하였다. 이 현상은 Caco-2 및 Calu-3 세포 모두에서 재현 가능했습니다. CFTR 활성은 포스콜린 또는 DMSO 자극 후 형광의 최대 변화의 차이로 계산되었습니다.
개별 포인트는 Forskolin 자극 및 DMSO 대조군의 경우 평균에서 플러스 또는 마이너스 3 표준 편차 사이였으며, 이는 분석의 재현성을 나타냅니다. 기능적 반응의 특이성을 확인하기 위해 이러한 막 전위 분석은 Ussing 챔버와 같은 기존의 전기생리학적 방법을 사용하여 추가로 검증할 수 있습니다. 이 플랫폼은 고처리량 변조기 스크린과 이종 발현 시스템 사이의 격차와 접근하기 어려운 일차 조직에서 시간이 많이 소요되는 생체 전기 측정 사이의 격차를 해소할 수 있습니다.
