Este enfoque guiado por linaje permite el análisis proteómico de eventos importantes del desarrollo con resolución espacial y temporal dentro del embrión vertebrado impartiendo información que no sería accesible a través de mediciones de embriones completos. Este enfoque se puede extender fácilmente para estudiar proteínas, metabolitos y transcripciones de diferentes células embrionarias a medida que se diferencian durante el desarrollo. Este método puede avanzar en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares que controlan el desarrollo normal y de la enfermedad, incluidos los mecanismos de inducción tisular y el compromiso del destino celular durante el desarrollo temprano.
Use un lazo de cabello para guiar cada embrión hacia un pozo y colóquelos suavemente para que la célula de interés objetivo esté en el ángulo correcto con la microaguja. Siga los mapas de destino del tejido de xenopus laevis para identificar la célula precursora del linaje de interés. Use dos pinzas de afilado para extraer suavemente la membrana vitelina que rodea el embrión.
Aislar las células individuales del embrión mediante disección manual con fórceps. Comience por colocar la aguja de inyección que contiene la solución trazadora de linaje. Monte la aguja de microinyección en un soporte de micropipeta controlado por un micromanipulador multieje.
Conecte el soporte de micropipeta a un microinyector y llene la aguja con el trazador de linaje aplicando presión negativa. Calibre la aguja y ajuste el tamaño de la punta de la aguja y el tiempo de inyección para entregar aproximadamente un nanolitro de la solución trazadora de linaje medida en aceite mineral. Asegúrese de que el tamaño de la gota que se inyecta sea preciso y ajuste la configuración del inyector si es necesario.
Inundar el plato de arcilla de microinyección con una solución de fCAL al 3% y transferir aproximadamente 10 embriones al plato de arcilla utilizando una pipeta de transferencia. Inyecte las células de interés con aproximadamente un nanolitro del dextrano fluorescente o 200 picogramos de ARNm de GFP. Usando un microscopio estereoscópico, confirme el éxito del etiquetado celular.
Asegúrese de que solo se inyecta la celda deseada. Deseche los embriones que contengan células lesionadas o etiquetadas incorrectamente siguiendo las políticas institucionales. Transfiera los embriones inyectados a una placa de Petri que contenga 0,5 veces la solución de Steinberg.
Cultivarlos entre 14 y 25 grados centígrados hasta que alcancen la etapa de desarrollo deseada. Transfiera de tres a cinco embriones a una placa de agar que contenga 0,2 veces la solución de Steinberg para microdiciones. Use fórceps para diseccionar el clon marcado del embrión.
Recoger el tejido disecado con una pipeta de 0,5 a 10 microlitros y depositarlos en una microcentrífuga. Usando una pipeta, aspire los medios que rodean el tejido recolectado para limitar las sales en la muestra y evitar interferencias con el análisis HRMS. Congelar inmediatamente las células aisladas colocando el vial de muestra sobre hielo seco o nitrógeno líquido.
Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta el análisis por espectrometría de masas. Para el procesamiento de muestras de una sola célula por CE, desnaturalice las proteínas calentando la muestra a 60 grados centígrados durante aproximadamente 15 minutos. Luego equilibre la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos y agregue tripsina a las muestras para la digestión.
Para el análisis por NanoLC, lisar hasta cinco tejidos disecados en 50 microlitros de tampón de lisis. Facilitar el proceso pipeteando la muestra hacia arriba y hacia abajo. Para procesar los tejidos disecados, incubar el lisado a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Luego pellet los restos celulares y las plaquetas de la yema a cuatro grados centígrados por centrificación a 4, 500 RCF. Transfiera el sobrenadante a un vial de microcentrífuga limpio y agregue 10% SDS para obtener una concentración final de 1% SDS en el lisado. Para los tejidos, agregue 0,5 ditiothreitol molar al lisado para obtener una concentración final de aproximadamente 25 milimolares.
Luego incubar el lisado durante 30 minutos a 60 grados centígrados para reducir químicamente los enlaces disulfuro en las proteínas. Añadir 0,5 molares de yodoacetamida para obtener la concentración final de aproximadamente 75 milimolares en el lisado e incubar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Agregue 0.5 ditiothreitol molar igual que el volumen inicial para apagar los reactivos restantes de la reacción de alquilación.
Precipitar proteínas en acetona durante la noche como se describe en el protocolo de texto y reconstituir en bicarbonato de amonio 0,5 molares. Agregue tripsina para la digestión de la muestra e incube los viales a 37 grados centígrados. Para separar los péptidos utilizando CE, reconstituya la proteína digerida en uno o dos microlitros del disolvente de muestra.
Vortex la muestra mezclada y la centrifusión a 10, 000 RCF durante dos minutos a cuatro grados Celsius a los restos de células de pellets. Inicialice el instrumento CE-ESI enjuagando el capilar CE con el BGE. Coloque un microlitro de muestra en el vial de muestra e inyecte de uno a 10 nanolitros de la muestra en el capilar de separación CE mediante inyección hidrodinámica.
Transfiera el extremo de entrada del capilar de separación CE al BGE. Comience la separación electroforética aumentando gradualmente el voltaje de separación CE desde tierra a tierra. Los potenciales de 20 a 28 kilovoltios con una corriente inferior a 10 microamperios garantizan un rendimiento instrumental estable y reproducible para el análisis.
Para separar utilizando Nano LC, vuelva a suspender la muestra de péptido en la fase móvil A. La concentración de la muestra y el volumen de inyección dependen del sistema y la columna de LC disponibles. Transfiera la muestra a un vial de LC. Cargue aproximadamente de 200 nanogramos a dos microgramos de muestra de péptido en la columna analítica C18 y separe los péptidos a una velocidad de flujo de 300 nanolitros por minuto utilizando la elución de gradiente como se describe en el texto manuscrito.
Con una cámara, verifique el flujo de líquido a través del emisor de electropulverización e inspeccione visualmente la configuración para detectar posibles fugas. Adquirir eventos de espectrometría de masas y secuenciar los péptidos como se describe en el texto manuscrito. Se detectaron diferencias de traducción génica entre las células D11 disecadas de diferentes embriones utilizando CE-ESI-HRMS.
Los clones de células disecadas marcadas con linaje fueron analizados por LC-HRMS. El análisis de la vía de las proteínas mostró una traducción de proteínas regulada al alza y el metabolismo energético en el organizador de Spemann con el neuroectodermo. El neuroectodermo prodeum se enriqueció en proteínas asociadas con el transporte nuclear de la carga de proteínas en la célula, lo que probablemente indica eventos aguas abajo después de la señalización.
El análisis de enriquecimiento de las funciones moleculares indicó una regulación positiva en la iniciación de la traducción, la unión al ARN y la unión del complejo proteasoma, lo que sugiere un papel para el recambio dinámico de proteínas que desarrolla el organizador de Spemann. Seleccione solo embriones estereotipados para este protocolo para mejorar la reproducibilidad y la interpretación de los resultados. El tejido diseccionado debe transferirse a un vial y congelarse inmediatamente que contenga el mínimo de amortiguador de medios posible para minimizar la contaminación de las sales tampón.
Este enfoque nos ha permitido estudiar la dinámica de proteínas en células identificadas y linajes celulares en embriones vivos. La nueva información que hemos obtenido sobre la producción temporal espacial de proteínas importantes en los tejidos en desarrollo nos ha permitido diseñar experimentos específicos para evaluar su función biológica.
