Damos las gracias a Yutian Gan para el uso de la figura 3. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias 0420971, el Smith College Blakeslee, Wilens y los fondos de Holmes, y el Howard Hughes Medical Institute.

1. Preparación de la muestra <ol><li> El uso de tejido fresco, congelado o en flash RNAlater tratos de los ratones como material de partida. Blot a la basura cualquier exceso con un conservante Kimwipe antes de proceder. </li><li> Eliminar todos los tendones y la fascia alrededor del músculo y el tejido con pelos en las hojas de afeitar solo filo para los 2 minutos en placas de vidrio enfriado en un cuarto frío (4 ° C) hasta que el tejido está bien picado o en polvo. Recoger la muestra en un tubo de microcentrífuga previamente pesado y determinar el peso del tejido. No utilice más de 10 mg de tejido como material de partida. </li><li> Añadir 45 l de tampón de extracción (8 M urea, 50 mM DTT, CHAPS 4%, 0,2% anfolitos transportista 5.8, 0,0002% bromofenol azul) por mg de tejido una picada, a temperatura ambiente. Si el volumen es superior a 350 l, 350 l añadir inicialmente y homogeneizar (paso 1.4), a continuación, añadir el resto del buffer para minimizar las salpicaduras. </li><li> Homogeneizar el tejido siete veces con un mazo motorizado (Kontes Corp) durante 15 segundos a4 ° C, con dos minutos de enfriamiento en hielo entre cada homogenización. </li><li> Centrifugar las muestras a 15.600 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Guardar el sobrenadante y medir su volumen. Los restos de sedimento de células se descarta. </li><li> Precipitar las proteínas en el sobrenadante con helado de acetona de grado reactivo (3 veces v: relación v). Vortex los tubos durante 15 segundos. Centrífuga para 15.600 xg durante 10 segundos para formar pellets y resuspender en tampón de extracción con el motor y barras de polipropileno Kontes agitación (BioSpec Prod) </li><li> Repita el paso 1.6. </li><li> O bien proceder a la estimación de concentración de proteínas de las muestras o almacenarlos a -20 ° C. </li></ol> 2. Proteína estimación de concentración Use el ensayo de Lowry 7 o el ensayo BCA 8 (Pierce), objetivo de unos 4,5 mg ml -1. 3. Isoelectroenfoque <ol><li> Quitar una tira IPG ReadyStrip (11 cm, pH 5.8, Bio-Rad)desde -20 ° C y deje que se equilibre a temperatura ambiente durante 10-15 min. </li><li> Vortex la muestra y la pipeta 600-800 mg (volumen total 200 l) de la muestra de la proteína en una línea recta en el borde posterior de un canal en la bandeja de rehidratación de la muestra, dejando aproximadamente 1 cm en cada extremo. </li><li> Con unas pinzas, retire la tapa de plástico de la tira IPG - Asegúrese de manejar sólo los extremos de la banda y evitar cualquier contacto con el gel. Nota final básicos de la tira y colocarla en el lado izquierdo de la bandeja. Coloque la tira IPG gel hacia abajo en la parte superior de la muestra, evite la retención de burbujas debajo. Deje que se rehidratan durante una hora. </li><li> Superposición con 2,5 ml de aceite mineral (BioRad). Cubra la bandeja con la tapa, y dejar hidratar durante la noche a temperatura ambiente. </li><li> Coloque una mecha de papel en ambos extremos del canal de la bandeja de enfoque y húmeda cada uno con 10 l de agua Millipore. </li><li> Saque la tira IPG y sosténgalo de forma vertical durante unos 10 segundos el desagüe el aceite. Seque la b de plásticoACKing con un Kimwipe. </li><li> Coloque el lado de la tira de gel IPG abajo y con fines básicos de la izquierda en la bandeja de enfoque. Cubrir la franja con 2,5 ml de aceite mineral. </li><li> Coloque la bandeja en la célula PROTEAN IEF (Bio-Rad) y el programa de un protocolo de 3 pasos (Tabla 1) a la temperatura de celda predeterminado de 20 ° C, una corriente máxima de 50 mA / tira, y no hay tiempo de rehidratación. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Voltaje </td><td> Tiempo </td><td> Volt-Horas </td><td> Rampa </td></tr><tr><td> Paso 1 </td><td> 250 </td><td> 20 min </td><td></td><td> Lineal </td></tr><tr><td> Paso 2 </td><td> 8000 </td><td> 2,5 horas </td><td></td><td> Lineal </td></tr><tr><td> Paso 3 </td><td> 8000 </td><td></td><td> 40.000 </td><td> Rápido </td></tr><tr><td> Total </td><td></td><td> 6,5 horas </td><td> 40.000 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Tres pasos del protocolo de Protean IEF celular de 11 cm IPG tiras. </li><li> Tome las tiras IPG fuera de la célula del IEF con el fórceps. Seque el respaldo de plástico con un Kimwipe y coloque el lado tira de gel IPG en una bandeja de rehidratación limpia. Puede cubrir la bandeja de rehidratación y envolverlo con papel plástico y almacenar a - 80 ° C o proceder. </li></ol> 4. SDS electroforesis en gel de poliacrilamida <ol><li> Transferencia de la franja (hasta gel de lado) en una bandeja de 11 cm de equilibrio. </li><li> Agregar 4 ml de tampón de reducción (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M de Tris / HCl pH 8,8, 20% de glicerol, 2% TDT) para el canal y equilibrar la tira durante 10 minutos con agitación suave. </li><li> Eliminar el buffer de reducción, añadir 4 ml de tampón de alquilación (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M de Tris / HCl pH 8,8, 20% de glicerol, un 2,5% yodoacetamida) y equilibrar la tira durante 10 minutos con agitación suave. </li><li> Enjuague la tira IPG por inmersión del STRIp brevemente en 1 X tampón SDS funcionamiento (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,2). </li><li> Coloque el lado del gel de la tira para arriba sobre la placa posterior de los 11 cm Criterio prefabricados 10,5% y un 14% Tris-HCl en gel de poliacrilamida SDS (Bio-Rad) y presione suavemente en el modo que se haga pleno contacto con el gel de SDS; asegurarse de que no haya burbujas atrapadas entre las dos superficies de gel. </li><li> Superposición de la tira IPG con 1 ml de solución de agarosa fundida (0,5% de agarosa, 25 mM Tris, 192 mM glicina, SDS 0,1%, azul de bromofenol) y dejar solidificar la agarosa durante 5 minutos. </li><li> Carga de 5 l de proteína marcadora 10-225 kDa (USB, P / N: 76740) en el único pozo como estándares de peso molecular. </li><li> Ejecute el gel de SDS buffer (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8.2) a 200 V a temperatura ambiente o en un cuarto frío (4 ° C), utilizando el azul de bromofenol migración frente tinte para controlar la electroforesis. </li><li> Quitar el gel de la fundición de plástico y mancha la noche agitando suavemente en azul brillante de CoomassieR-250 mancha (45,5% de metanol, el 45,5% dH2O, el 9,0% de ácido acético, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250). </li><li> Agite el gel en una solución Destain (45,5% de metanol, el 45,5% dH 2 O, 9,0% de ácido acético) dos veces durante 3 horas cada uno y en Destain 2 (5% de metanol, 90% dH 2 O, 5% de ácido acético) durante la noche. Guarde el gel en el 7% de ácido acético para el análisis. </li></ol> 5. Gel de imágenes y análisis <ol><li> Capturar imágenes de los geles utilizando la cantidad Un programa de software que opera el sistema de imágenes VersaDoc (BioRad). Cultivos las áreas de imagen de manera uniforme para todos los geles en su experimento. </li><li> Cargar las imágenes recortadas en el programa PDQuest software 8.0 para crear un conjunto de experimentos. Siga el asistente de configuración experimento para definir los parámetros para la detección de puntos y el punto correspondiente a través de los geles. Revisar y perfeccionar el lugar correspondiente los resultados manualmente si es necesario. </li><li> Realizar un análisis cuantitativo y estadístico de los geles para detectar manchas de proteínas emparejado con twdiferencias estadísticamente significativas o veces o más en la expresión entre los dos grupos de gel. Crear un análisis conjunto de estos puntos de interés y recortarlas utilizando un cortador lugar EXQuest (BioRad) para la digestión de la tripsina y la LC-MS-basado en la identificación de proteínas. </li></ol> 6. En-gel tríptico digestión Para este paso un Pierce modificado en gel tríptico Compendio Kit (# 89871X, Pierce) se utiliza el protocolo. <ol><li> Añadir 200 l de solución decolorante (25 mM de bicarbonato de amonio, el 50% de acetonitrilo) a los enchufes de gel. Agitar e incubar las muestras a 37 ° C durante 30 minutos con agitación. Retire con cuidado y deseche la solución. </li><li> Repita el paso 6.1. </li><li> Añadir 30 l de tampón recién preparado la reducción (50 mM Tris [2-carboxietil] fosfina, un 22,5 mM de bicarbonato de amonio) a los tubos con los tapones de gel e incubar a 60 ° C durante 10 minutos. </li><li> Permita que las muestras que se enfríe, luego retirar y desechar el buffer de la reducción.</li><li> Añadir 30 l de tampón de alquilación (100 mM yodoacetamida, 20 mM de bicarbonato de amonio, preparada inmediatamente antes de su uso en tubos envueltos en papel de aluminio. Incubar las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Retire y deseche el buffer de alquilación. Lave los tapones de gel mediante la adición de 200 l de solución de decoloración de cada tubo. Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 minutos. </li><li> Retire y deseche la solución decolorante y repetir el lavado. </li><li> Añadir 50 l de acetonitrilo a los tapones de gel e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente para permitir que se contraigan en seco, a continuación, retire con cuidado el acetonitrilo. </li><li> Repita el paso 6.8, una vez más. Piezas de gel debe verse blanca y pequeña. </li><li> Permiten que las piezas de gel se seque en un concentrador de CentriVap (Labconco, modelo EX1245) durante 10 minutos. </li><li> Engrosar las piezas de gel mediante la adición de 10 l de solución de tripsina activada (10 tripsina ng / l, 25 mM de bicarbonato de amonio). Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. </li><li> Añadir 25 l tampón de digestión (25 mM de bicarbonato de amonio) a los tubos. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante la noche con agitación. </li><li> Sonicar las muestras durante 10 minutos (Branson, modelo baño sonicador 2510) y el giro hacia abajo antes de retirar el sobrenadante a un tubo nuevo. Guardar el sobrenadante. </li><li> A fin de extraer los péptidos, se añaden 10 l de 0,1% de ácido fórmico y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente con agitación. Sonicar las muestras durante 10 minutos, recoge el sobrenadante y se combinan con sobrenadante guardado en el paso 6.13. </li></ol> 7. Desalación microescala de los extractos peptídicos <ol><li> Eliminar el bicarbonato de amonio y otras sales en los extractos peptídicos con la ayuda de PepClean C-18 columnas de centrifugado (ThermoFisher) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Péptidos eluir dos veces con 20 l de acetonitrilo 70%, se evaporan las muestras secas por centrifugación en el Concentrador CentriVap durante 1 hora y resuspenderlos péptidos en 10 l de ácido fórmico al 0,1% para el análisis de MS. </li></ol> 8. La identificación de proteínas por HPLC-espectrometría de masas acoplada <ol><li> Independiente de 5 l de la mezcla de péptidos en un cromatógrafo de líquidos de alta eficacia (HPLC) de más de 40 minutos, utilizando un gradiente lineal de 20 a 50% de acetonitrilo con 0,2% de ácido fórmico en una Pepswift monolítica PS-DVB columna (Dionex) acoplado a un nanospray I de origen en un espectrómetro de trampa de iones de masas (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) con un caudal de 400 nL / min en la punta. </li><li> Detectar péptido MS1 señales entre 400 a 1400 m / z y permiten los 3 picos de iones más intensos que ser aislado para MS2 secuenciación por CID con la exclusión dinámica. </li><li> Para la identificación de proteínas, análisis de los resultados de péptidos a través de una búsqueda de base de datos de referencia del ratón Sequest (BioWorks software Thermo-Fisher Scientific) con una modificación de la cisteína estática alquiladas y modificaciones dinámicas de la fosforilación (serina, treonina, tirosina), metilaciónción (histidina), oxidación (metionina), ADP-ribosilación (arginina), y la acetilación N-terminal. Aplicar criterios de coincidencia conservadora (por ejemplo, la tolerancia péptido establece en 2 UMA y 1,00 tolerancia fragmento, proteínas contienen al menos dos péptidos pasar un Xcorr vs Estado de carga del filtro [z = 1 / x = 1.5, z = 2 / x = 2.00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3,00] y una probabilidad de p &lt;0,05) y cinco inspeccionar manualmente los espectros de MS para la identificación de proteínas confianza. </li></ol> 9. Los resultados representativos: Hombres y mujeres no ejercidas, el músculo esquelético murino (bíceps braquial) se extrae y se separa en un mapa en dos dimensiones 5, el primer nivel del músculo comparativo del proteoma (Figura 2). Una vez visualizado el uso de alta resolución de imágenes digitales, cerca de 800 puntos de la proteína fueron detectados en cada uno. Utilizando el mapa del proteoma masculina como una línea de base, está claro que hay numerosos lugares que el cambio en la abundancia en el proteoma de las mujeres. La intensidad de mancha se<html> medidas del cambio en las cantidades de proteínas (Figura 3). Las identidades de las manchas de proteínas que cambian más de dos veces (hacia arriba o hacia abajo) y son estadísticamente significativas (p &lt;0,05) con un n = 5 ratones, se determinó mediante análisis de la secuencia de aminoácidos utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas acoplada. Estos resultados muestran que las mujeres demuestran una disminución de la abundancia de las enzimas de azúcar en el metabolismo energético y en la enzima creatina quinasa (CK) isoformas, un sistema de suministro de energía diferentes en los músculos. Los seres humanos y animales muestran mayores niveles séricos de CK macho en reposo y después del ejercicio 9,10, pero los niveles séricos de CK no se corresponden necesariamente con la cantidad de interrupciones miofibrilar 11,12. Este dimorfismo de género en la abundancia celular de CK en el músculo bíceps braquial murino es una novela finding5 y puede responder a las fisiológicamente diferentes niveles séricos de CK. Cifras: g1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Un esquema general del protocolo para la proteómica comparativa. El protocolo se divide en tres grupos: preparación de muestras, análisis de la muestra, y, la identificación de proteínas. Los extremos de cada uno de estos tres grupos de protocolos también están haciendo una pausa razonable lugares, aunque los mejores resultados se obtuvo, si el protocolo general se lleva a cabo sin parar. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" /> Figura 2. Comparación de las mujeres proteína murina bíceps braquial puntos en relación con los puntos idénticos en bíceps braquial masculino (verde o círculos). Puntos que el aumento mayor o igual a dos veces en las mujeres con un círculo rojo (o) y los que bajaron menos que o igual a dos veces con un círculo azul (o). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" /> Figura 3 Punto Gel Análisis de Intensidad:. Del eje X, las mujeresantes del ejercicio (control, n = 5), eje Y, las mujeres solteras que pelea 0 grupo de puntos de horas de tiempo (n = 5). Línea de regresión: coeficiente de correlación = 0,919; pendiente = 0,976; interceptar = -0.0293. Puntos por encima de la línea roja y por debajo de la línea azul cambiar más de + / - dos veces.

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No hay conflictos de interés declarado.

El método de LC / MS proteómica que aquí se presenta es un protocolo más fiable y reproducible para un análisis rápido del primer nivel del proteoma del músculo esquelético. Además, permite una comparación razonable expediente de la especificidad de género. Proteínas de baja abundancia que requieren un fraccionamiento de la muestra de músculo para eliminar la mayor cantidad de proteínas contráctiles como sea posible, lo que aumenta las proteínas de baja abundancia. Adaptar el perfil de proteoma se puede lograr con diferentes tiras IPG rango de pH y un suplente geles de gradiente porcentaje si así lo desea. Colorantes fluorescentes más sensibles existen, pero se recomienda que cada laboratorio determine la linealidad de estas manchas en su sistema. Para un análisis más riguroso de la expresión proteica del sistema DIGE (bidimensional en gel de electroforesis sistema, GE Healthcare Life Sciences) se puede utilizar, sin embargo esto se le añade un nivel de complejidad de la metodología. Además, el protocolo descrito en este documento se puede utilizar con la mayoría de los animalestejidos mal para el que ha sido una secuencia del genoma, así como de secuenciación de novo de una proteína a partir de cualquier fuente, siempre y cuando se puede resolver en un gel de dos dimensiones, ya que se superponen fragmentos enzimática se puede generar el uso de enzimas de alta pureza, además de a la tripsina. Las muestras de tejido de otras fuentes pueden requerir algunas modificaciones en la metodología de extracción, especialmente si busca proteínas de la membrana e hidrofóbicas, sin embargo, hemos tenido buenos resultados con este protocolo con el corazón, el hígado, los riñones y los tejidos del cerebro. Otras modificaciones post-traduccionales se pueden detectar mediante la modificación del espectro de masas criterios de búsqueda de base de datos. En resumen, hemos presentado un protocolo inicial razonablemente detallado para el análisis de perfiles proteoma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Tipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> PepClean C-18 Giro Columnas </td><td> Consumible </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> PI-89870 </td><td></td></tr><tr><td> Monolítica Pepswift columna (100um x 5 cm) </td><td> Consumible </td><td> Dionex </td><td> 162348 </td><td></td></tr><tr><td> Criterio prefabricado 10,5% y un 14% Tris-HCl SDS geles de poliacrilamida </td><td> Consumible </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> Readystrip tiras IPG </td><td> Consumible </td><td> BioRad </td><td> Diferentes pH rangos de </td><td></td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A465-1 </td><td></td></tr><tr><td> Acetona </td><td> Reactivo </td><td> Pharmco </td><td> 329000 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrilo </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reactivo </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> Superposición solución </td></tr><tr><td> De bicarbonato de amonio </td><td> Reactivo </td><td> Fluka </td><td> 40867 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Lyte anfolitos </td><td> Reactivo </td><td> BioRad </td><td></td><td> Diferentes pH rangos de </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Reactivo </td><td> USB </td><td> 13361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie blue R-250 </td><td> Reactivo </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 20278 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td> Reactivo </td><td> USB </td><td> 15395 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido fórmico </td><td> Reactivo </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 28905 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerol </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td> Reactivo </td><td> USB </td><td> 16407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Yodoacetamida </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Reactivo </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> De aceite mineral </td><td> Reactivo </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecilsulfato de sodio </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> Tris base </td><td> Reactivo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93349 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [2-carboexyethyl] fosfina </td><td> Reactivo </td><td> ThermoFisher Científico </td><td> 77720 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina endoproteinasa, TPCK tratada, MS grado </td><td> Reactivo </td><td> Atravesar </td><td> 90055 </td><td> modificado </td></tr><tr><td> Urea </td><td> Reactivo </td><td> USB </td><td> 75826 </td><td></td></tr><tr><td> De agua </td><td> Reactivo </td><td> Burdick &amp; Jackson </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> CentriVap Concentrador </td><td> TOOL </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest cortador de lugar </td><td> Herramienta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQ Deca XP Max ion espectrómetro de masas de trampa </td><td> Herramienta </td><td> ThermoFisher Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Motorizados maja </td><td> Herramienta </td><td> Kontes Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polipropileno agitando </td><td> Herramienta </td><td> BioSpec Prod </td><td></td><td></td></tr><tr><td> barras </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PROTEAN IEF celular </td><td> Herramienta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sonicator </td><td> Herramienta </td><td> Branson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Además HPLC Surveyor sistema </td><td> Herramienta </td><td> ThermoFisher Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc imágenes sistema </td><td> Herramienta </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skeletal muscle gender dimorphism from proteomics

Contracción bruto en el músculo esquelético está determinada principalmente por un número relativamente pequeño de las proteínas contráctiles, sin embargo, este tejido es también muy adaptable a los factores ambientales, tales como un ejercicio de resistencia por la hipertrofia y atrofia por desuso. Es lo que muestra la remodelación y adaptación a los factores de estrés (calor, isquemia, metales pesados, etc.) 2,3. El daño puede ocurrir en el músculo por músculo ejerce una fuerza, mientras que el alargamiento, el 4 llamado contracción excéntrica. Las proteínas contráctiles puede ser dañado en tales esfuerzos y necesita ser reparado, degradados y / o resintetizado, estas funciones no son parte de las proteínas contráctiles, sino de otras proteínas y mucho menos abundantes en la célula. Para determinar qué subconjunto de proteínas está implicada en la mejora de este tipo de daño, el proteoma global debe ser establecido antes del ejercicio 5 y luego seguir como consecuencia del ejercicio para determinar el diferencialexpresión de la proteína y por lo tanto poner de relieve las proteínas candidatas en las adaptaciones a los daños y su reparación. Además, la mayoría de los estudios de los músculos esqueléticos se han realizado en el macho de la especie y por lo tanto puede no ser representativa de músculo femenino. En este artículo se presenta un método para extraer las proteínas de los músculos de forma reproducible hombres y mujeres, y los separa por electroforesis bidimensional en gel seguido de imágenes de alta resolución digital 6. Esto proporciona un protocolo de puntos (y de las proteínas identificadas posteriormente), que muestran una diferencia estadísticamente significativa (p &lt;0,05) de dos veces el aumento o disminución, aparecen o desaparecen del estado de control. Estos se extirpa, se digieren con tripsina y se separaron por cromatografía líquida de alta presión, acoplado a un espectrómetro de masas (LC / MS) para la identificación de proteínas (LC / MS / MS) 5. Esta metodología (Figura 1) se puede utilizar en muchos tejidos con poca o ninguna modificación (hígado, cerebro, oídot etc.).

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Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Un conjunto de straight-forward de los métodos para aislar y determinar la identidad de las proteínas más abundantes se expresa en el músculo esquelético. Cerca de 800 puntos se vislumbran en un gel bidimensional de los músculos de 10 mg, lo que permite la determinación de los específicos de género expresión de la proteína. Estos métodos dan resultados equivalentes en la mayoría de los tejidos.

Músculo Esquelético dimorfismo de género de Proteómica

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.4K vistas.  Smith College. Un conjunto de straight-forward de los métodos para aislar y determinar la identidad de las proteínas más abundantes se expresa en el músculo esquelético. Cerca de 800 puntos se vislumbran en un gel bidimensional de los músculos de 10 mg, lo que permite la determinación de los específicos de género expresión de la proteína. Estos métodos dan resultados equivalentes en la mayoría de los tejidos.

Video: Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-mecánico Análisis de músculo esquelético aislado

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Investigación

Medicina

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. Although originally developed and used extensively in the rat due to its larger size, the tibial nerve in mice is big enough that it can be easily manipulated with either crush or transection, leaving the peroneal and sural nerve branches of the sciatic nerve intact and thereby preserving their target muscles. Thus, this model offers the advantages of inducing less morbidity and impediment of ambulation than the sciatic nerve transection model and also allows investigators to study the physiologic, cellular and molecular biologic mechanisms regulating the process of muscle atrophy in genetically engineered mice. The tibial nerve supplies the gastrocnemius, soleus and plantaris muscles, so its transection permits the study of denervated skeletal muscle composed of fast twitch type II fibers and/or slow twitch type I fibers. Here we demonstrate the tibial nerve transection model in the C57Black6 mouse. We assess the atrophy of the gastrocnemius muscle, as a representative muscle, at 1, 2, and 4 weeks post-denervation by measuring muscle weights and fiber type specific cross-sectional area on paraffin-embedded histologic sections immunostained for fast twitch myosin.

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of skeletal muscle atrophy. The model surgical protocol is described and demonstrated in C57Black6 mice. &#160;

Transección del nervio tibial - Un modelo normalizado para la atrofia del músculo esquelético denervación inducida en ratones

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&amp;#246;m Technique

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Procedimientos de biopsia de músculo esquelético humano utilizando la técnica de Bergström Modificado

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

Imágenes por resonancia magnética cuantitativa de la enfermedad del músculo esquelético

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Humano<em&gt; vasto externo</em&gt; Esquelético biopsia muscular utilizando el Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

Inducción y evaluación de daños de esfuerzo del músculo esquelético en seres humanos

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

El fósforo-31 espectroscopía de resonancia magnética: una herramienta para medir<em&gt; En Vivo</em&gt; Capacidad de la fosforilación oxidativa mitocondrial en el músculo esquelético humano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of myosin heavy chain (MyHC) isoforms has emerged as a finer discriminator of fiber-type. Type I, type IIA, type IIX and type IIB fibers can now be identified with precision based on their MyHC profile; however, manual analysis of these data can be slow and down-right tedious. In this regard, rapid, accurate assessment of fiber-type composition and morphology is a very desirable tool. Here, we present a protocol for state-of-the-art immunohistochemical staining of MyHCs in frozen sections obtained from mouse hindlimb muscle in concert with a novel semi-automated algorithm that accelerates analysis of fiber-type and fiber morphology. As expected, the soleus muscle displayed staining for type I and type IIA fibers, but not for type IIX or type IIB fibers. On the other hand, the tibialis anterior muscle was composed predominantly of type IIX and type IIB fibers, a small fraction of type IIA fibers and little or no type I fibers. Several image transformations were used to generate probability maps for the purpose of measuring different aspects of fiber morphology (i.e., cross-sectional area (CSA), maximal and minimal Feret diameter). The values obtained for these parameters were then compared with manually-obtained values. No significant differences were observed between either mode of analysis with regards to CSA, maximal or minimal Feret diameter (all p &#62; 0.05), indicating the accuracy of our method. Thus, our immunostaining analysis protocol may be applied to the investigation of effects on muscle composition in many models of aging and myopathy.

Immunohistochemical staining of myosin heavy chain isoforms has emerged as the state-of-the-art discriminator of skeletal muscle fiber-type (i.e., type I, type IIA, type IIX, type IIB). Here, we present a staining protocol along with a novel semi-automated algorithm that facilitates rapid assessment of fiber-type and fiber morphology.

Análisis semi-automatizado de fibra tipo composición y morfología del músculo esquelético de ratón

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic demand. Reactive hyperemia (in response to a brief period of tissue ischemia) is an independent predictor of cardiovascular events and provides important insight into vascular health and vasodilatory capacity. Skeletal muscle oxidative capacity is equally important in health and disease, as it determines the energy supply for myocellular processes. Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess each of these major clinical endpoints (reactive hyperemia, neurovascular coupling, and muscle oxidative capacity) during a single clinic or laboratory visit. Unlike Doppler ultrasound, magnetic resonance images/spectroscopy, or invasive catheter-based flow measurements or muscle biopsies, our approach is less operator-dependent, low-cost, and completely non-invasive. Representative data from our lab taken together with summary data from previously published literature illustrate the utility of each of these end-points. Once this technique is mastered, application to clinical populations will provide important mechanistic insight into exercise intolerance and cardiovascular dysfunction.

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with &#039;One Stop Shop&#039; Near-infrared Spectroscopy

Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia, neurovascular coupling and skeletal muscle oxidative capacity in a single clinic or laboratory visit.

Músculo esquelético Neurovascular acoplamiento, capacidad oxidativa y la función Microvascular con espectroscopia del infrarrojo cercano "Una parada tienda"

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...