El método MycoPatt permite una exploración en profundidad de la colonización micorrízica arbuscular en raíces. Los mapas de micorrizas apuntan a la expansión fúngica y presentan la posición real de cada estructura como un patrón específico. La colonización micorrízica se analiza objetivamente con una resolución del 1%.
Cada segmento raíz se convierte automáticamente en una matriz digital y genera una extensa base de datos de parámetros de colonización. Para comenzar, retire las raíces del refrigerador y colóquelas en una plataforma de trabajo para descongelar a temperatura ambiente. Para realizar la limpieza de raíces, coloque todas las raíces de una planta en un frasco de 30 a 50 mililitros, luego prepare una solución de hidróxido de sodio al 10% con agua del grifo y viértala en el frasco hasta que cubra completamente las raíces.
Agite el frasco vigorosamente durante uno o dos minutos para una dispersión homogénea de la solución de limpieza en las raíces. Permita que las raíces permanezcan en la solución de limpieza durante 48 horas. Para el enjuague de la raíz, pase el contenido del frasco a través de un tamiz.
Enjuague las raíces varias veces con agua del grifo hasta que la solución de limpieza se elimine por completo. A continuación, coloque las raíces enjuagadas en un frasco limpio para teñir. Luego prepare una solución de vinagre de tinta de cinco a cinco por ciento con agua del grifo.
Viértelo en el frasco hasta que cubra las raíces y agítalo durante uno o dos minutos. Después de 48 horas para la detinción parcial, enjuague las raíces manchadas en agua del grifo durante uno o dos minutos. Agite el frasco vigorosamente para eliminar la solución de tinción adicional.
Repita el procedimiento hasta que las raíces estén claras para la evaluación microscópica. Para la segmentación de la raíz, coloque las raíces manchadas en una tabla de cortar a escala. Corta las raíces en segmentos de un centímetro.
Elija 15 segmentos para cada variante. A continuación, extienda las raíces en un portaobjetos para la preparación del segmento, use una bolsa laminadora para cubrir las raíces y aplastarlas suavemente, comenzando desde un borde. Use una herramienta de plástico blando para mostrar las raíces en el portaobjetos.
Retire con cuidado la bolsa laminadora y cubra la muestra con un cubreobjetos. Agregue agua a una esquina del tobogán con una pipeta y deje que el agua se extienda lentamente sobre el tobogán. Retire el exceso de agua con una toalla de papel.
Para el análisis microscópico, utilice un microscopio equipado con una cámara de buena resolución. Analice las diapositivas a partir de una extremidad. Captura cada campo microscópico.
Use un aumento de 10 o 40x para raíces gruesas y 40x para raíces delgadas. Después de la captura, cambie el nombre de cada imagen con un código que permita el post-ensamblaje real de las partes raíz. Utilice el software de presentación para diseñar un tablero de dibujo para el ensamblaje de imágenes, establezca el ancho de dos a tres centímetros más ancho que el ancho de la imagen.
Después de capturar 15 imágenes, agregue todas las imágenes capturadas de un segmento en el orden de su captura, comenzando con una a 15, y reconstruya toda la longitud del segmento raíz. A continuación, use la alineación vertical para alinear las imágenes en el centro y asegúrese de que cada imagen siga a la anterior. Coloque una cuadrícula de 10 por 150 celdas en todas las imágenes para cubrir todo el segmento de la raíz.
Además, coloque una cuadrícula de 10 por 10 en cada imagen y en cada celda de esta cuadrícula, inserte un número del uno al seis si una estructura arbuscular de micorrizas o AM es visible, o déjela en blanco si no hay estructura AM presente. Agregue una tabla para una cuadrícula de 10 celdas de ancho y 150 celdas de longitud. Cambie la tabla con dimensiones al ancho de las imágenes y, a continuación, cambie la longitud de la tabla para que comprenda todas las imágenes.
Para calificar la colonización micorrízica, use el número único para calificar cada tipo de estructura como se describe en el método de patrón micorrízico. Use uno para hifas, dos para arbúsculos, tres para vesículas, cuatro para esporas, cinco para células auxiliares y seis para puntos de entrada. Puntúe cada estructura micorrízica observada de cada celda de las cuadrículas aplicadas anteriormente.
Después de puntuar, inserte todas las puntuaciones obtenidas en la hoja de cálculo MycoPatt. Utilice la función de copiar y pegar para transferir todas las puntuaciones de la presentación a la primera hoja denominada Datos sin procesar. Para el análisis primario, utilice la tercera hoja denominada Parámetros para visualizar los resultados como porcentajes por separado en tres formas.
Utilice las columnas A a K para analizar la imagen horizontal de la colonización, las columnas M a W para la imagen vertical de la colonización y las columnas Y a AI para analizar la colonización transversal para cada uno de los 15 cuadrados de 10 por 10 y la colonización promedio final. A continuación, aplique las definiciones y fórmulas específicas de cada parámetro. Para la producción y extracción de mapas micorrízicos, visualice la imagen obtenida de la conversión del código de estructuras micorrízicas en colores en la segunda hoja denominada Gráficos.
A continuación, exporte la imagen resultante en la hoja gráfica como una imagen y utilice el código de color de la leyenda para analizar los patrones micorrízicos. Para el análisis de mapas micorrízicos, identifique las estructuras más importantes y su ensamblaje. Luego describa el patrón de colonización micorrízica observado en las raíces analizadas, seguido de una estrategia de colonización basada en el desarrollo estructural observado en la raíz, el patrón de ramificación y el desarrollo de vesículas arbusculares.
Este protocolo proporciona los detalles de las estructuras micorrízicas con buen contraste entre las estructuras micorrízicas y las células radiculares para Zea mays y Festal rubra. Los procedimientos infructuosos de limpieza y tinción dieron como resultado imágenes microscópicas poco claras de estructuras micorrízicas en Festal rubra y Zea mays. Los patrones de colonización micorrízica permitieron una exploración completa del mecanismo de colonización, este método proporciona una exploración profunda y a pequeña escala de los patrones de colonización y las estrategias para Zea mays y Festuca rubra con una expresión visual adicional de los parámetros de colonización.
En Zea mays se observó un potencial de colonización altamente fluctuante dependiendo de la etapa de desarrollo de la planta, sin embargo, en Festuca rubra, los procesos de colonización ocurren dentro de las raíces y el desarrollo de redes hifales se correlacionó con una baja velocidad de desarrollo de las raíces. MycoPatt es adecuado para mapear la colonización micorrízica arbuscular en cualquier planta. También es útil explorar completamente el mecanismo de colonización y evaluar la estrategia fúngica a lo largo de las raíces.
