Il metodo MycoPatt consente un'esplorazione approfondita della colonizzazione micorrizica arbuscolare nelle radici. Le mappe micorriziche indicano l'espansione fungina e presentano la posizione reale di ciascuna struttura come un modello specifico. La colonizzazione micorrizica viene analizzata oggettivamente con una risoluzione dell'1%.
Ogni segmento radice viene automaticamente convertito in una matrice digitale e genera un ampio database di parametri di colonizzazione. Per iniziare, rimuovere le radici dal frigorifero e posizionarle su una piattaforma di lavoro per lo scongelamento a temperatura ambiente. Per eseguire la pulizia delle radici, posizionare tutte le radici di una pianta in un barattolo da 30 a 50 millilitri, quindi preparare una soluzione di idrossido di sodio al 10% con acqua di rubinetto e versarla nel barattolo fino a coprire completamente le radici.
Agitare vigorosamente il barattolo per uno o due minuti per una dispersione omogenea della soluzione di pulizia nelle radici. Lasciare che le radici rimangano nella soluzione di compensazione per 48 ore. Per il risciacquo delle radici, passare il contenuto del barattolo attraverso un setaccio.
Risciacquare le radici più volte in acqua di rubinetto fino a completa rimozione della soluzione di pulizia. Quindi posizionare le radici sciacquate in un barattolo pulito per la colorazione. Quindi preparare una soluzione di aceto di inchiostro da cinque a cinque percento con acqua di rubinetto.
Versalo nel barattolo fino a coprire le radici e agitalo per uno o due minuti. Dopo 48 ore per la decolorazione parziale, sciacquare le radici macchiate in acqua di rubinetto per uno o due minuti. Agitare vigorosamente il barattolo per rimuovere la soluzione macchiante in eccesso.
Ripetere la procedura fino a quando le radici sono chiare per la valutazione microscopica. Per la segmentazione delle radici, posizionare le radici macchiate su un tagliere scalato. Tagliare le radici in segmenti di un centimetro.
Scegli 15 segmenti per ogni variante. Quindi, distribuire le radici su un vetrino per la preparazione del segmento, utilizzare una busta di laminazione per coprire le radici e schiacciarle delicatamente, partendo da un bordo. Utilizzare uno strumento di plastica morbida per visualizzare le radici sulla diapositiva.
Rimuovere con cautela la busta di laminazione e coprire il campione con un vetrino di copertura. Aggiungere acqua a un angolo del vetrino con una pipetta e lasciare che l'acqua si diffonda lentamente sul vetrino. Rimuovere l'acqua in eccesso con un tovagliolo di carta.
Per l'analisi microscopica, utilizzare un microscopio dotato di una fotocamera di buona risoluzione. Analizza le diapositive partendo da un'estremità. Cattura ogni campo microscopico.
Utilizzare un ingrandimento 10 o 40x per radici spesse e 40x per radici sottili. Dopo l'acquisizione, rinominare ogni immagine con un codice che consentirà il vero post-assemblaggio delle parti radice. Utilizzare il software di presentazione per progettare un tavolo da disegno per l'assemblaggio delle immagini, impostare la larghezza da due a tre centimetri più larga della larghezza dell'immagine.
Dopo aver acquisito 15 immagini, aggiungere tutte le immagini acquisite da un segmento nell'ordine di acquisizione, iniziando da uno a 15, e ricostruire l'intera lunghezza del segmento radice. Quindi, utilizza l'allineamento verticale per allineare le immagini al centro e assicurati che ogni immagine segua quella precedente. Posiziona una griglia di 10 per 150 celle su tutte le immagini per coprire l'intero segmento radice.
Inoltre, posizionare una griglia 10 per 10 su ogni immagine e in ogni cella di questa griglia, inserire un numero da uno a sei se è visibile una struttura micorrizica arbuscolare o AM o lasciare vuota se non è presente alcuna struttura AM. Aggiungere una tabella per una griglia di 10 celle di larghezza e 150 celle di lunghezza. Modificare la tabella con le dimensioni in base alla larghezza delle immagini, quindi modificare la lunghezza della tabella in modo che comprenda tutte le immagini.
Per assegnare un punteggio alla colonizzazione micorrizica, utilizzare il numero univoco per valutare ciascun tipo di struttura come descritto nel metodo del pattern micorrizico. Usa uno per le ife, due per gli arbuscoli, tre per le vescicole, quattro per le spore, cinque per le cellule ausiliarie e sei per i punti di ingresso. Assegna un punteggio a ciascuna struttura micorrizica osservata da ciascuna cellula delle griglie precedentemente applicate.
Dopo aver ottenuto il punteggio, inserisci tutti i punteggi ottenuti nel foglio di calcolo MycoPatt. Utilizzare la funzione copia incolla per trasferire tutti i punteggi dalla presentazione nel primo foglio denominato Dati grezzi. Per l'analisi primaria, utilizzare il terzo foglio denominato Parametri per visualizzare i risultati come percentuali separatamente in tre forme.
Usa le colonne da A a K per analizzare l'immagine orizzontale della colonizzazione, le colonne da M a W per l'immagine verticale della colonizzazione e le colonne da Y a AI per analizzare la colonizzazione trasversale per ciascuno dei 15 quadrati 10 per 10 e la colonizzazione media finale. Quindi, applicare le definizioni e le formule specifiche per ogni parametro. Per la produzione e l'estrazione di mappe micorriziche, visualizzare l'immagine ottenuta dalla conversione del codice delle strutture micorriziche in colori nel secondo foglio denominato Grafici.
Quindi esportare l'immagine risultante nel foglio grafico come immagine e utilizzare il codice colore nella legenda per analizzare i modelli micorrizici. Per l'analisi della mappa micorrizica, identificare le strutture più importanti e il loro assemblaggio. Quindi descrivere il modello di colonizzazione micorrizica osservato nelle radici analizzate, seguito da una strategia di colonizzazione basata sullo sviluppo strutturale osservato nella radice, sul modello di ramificazione e sullo sviluppo delle vescicole arbuscolari.
Questo protocollo fornisce i dettagli delle strutture micorriziche con un buon contrasto tra strutture micorriziche e cellule radicali per Zea mays e Festal rubra. Le procedure di pulizia e colorazione infruttuose hanno portato a immagini microscopiche poco chiare delle strutture micorriziche in Festal rubra e Zea mays. I modelli di colonizzazione micorrizica hanno permesso un'esplorazione completa del meccanismo di colonizzazione, questo metodo fornisce un'esplorazione profonda e su piccola scala dei modelli e delle strategie di colonizzazione per Zea mays e Festuca rubra con un'ulteriore espressione visiva dei parametri di colonizzazione.
In Zea mays è stato osservato un potenziale di colonizzazione altamente fluttuante a seconda dello stadio di sviluppo della pianta, tuttavia, in Festuca rubra, i processi di colonizzazione avvengono all'interno delle radici e lo sviluppo di reti ifali è stato correlato con una bassa velocità di sviluppo delle radici. MycoPatt è adatto per mappare la colonizzazione micorrizica arbuscolare in qualsiasi pianta. È anche utile esplorare a fondo il meccanismo di colonizzazione e valutare la strategia fungina lungo le radici.
