MycoPatt法は、根のアーバスキュラー菌根コロニー形成の詳細な調査を可能にします。菌根マップは真菌の増殖を指し、各構造の実際の位置を特定のパターンとして提示します。菌根コロニー形成は1%の分解能で客観的に分析されます。
各ルートセグメントは自動的にデジタルマトリックスに変換され、コロニー形成パラメータの広範なデータベースを生成します。はじめに、根を冷蔵庫から取り出し、室温で解凍するための作業台に置きます。根の除去を実行するには、1つの植物からのすべての根を30〜50ミリリットルの瓶に入れ、次に水道水で10%水酸化ナトリウム溶液を調製し、根を完全に覆うまで瓶に注ぎます。
根に透明化溶液が均一に分散するように、瓶を1〜2分間激しく振ってください。根を透明溶液に48時間放置します。根ですすぐには、瓶の中身をふるいにかけます。
透明溶液が完全に除去されるまで、根を水道水で数回すすいでください。次に、すすいだ根をきれいな瓶に入れて染色します。次に、水道水で5〜5パーセントのインク酢溶液を準備します。
それが根を覆うまでそれを瓶に注ぎ、1〜2分間それを振る。部分的な脱色のために48時間後、染色した根を水道水で1〜2分間すすぎます。ジャーを激しく振って、余分な染色液を取り除きます。
顕微鏡評価のために根が透明になるまで手順を繰り返します。根のセグメンテーションのために、染色された根をスケーリングされたまな板の上に置きます。根を1センチメートルのセグメントに切ります。
バリエーションごとに 15 個のセグメントを選択します。次に、セグメントの準備のためにスライドに根を広げ、ラミネートポーチを使用して根を覆い、端から始めて静かにつぶします。柔らかいプラスチック製のツールを使用して、スライドに根を表示します。
ラミネートポーチを慎重に取り外し、サンプルをカバースリップで覆います。ピペットでスライドの角に水を加え、水をスライドにゆっくりと広げます。ペーパータオルで余分な水を取り除きます。
顕微鏡分析には、高解像度のカメラを備えた顕微鏡を使用してください。四肢からスライドを分析します。各微視的なフィールドをキャプチャします。
太い根には10倍または40倍の倍率を使用し、細い根には40倍の倍率を使用します。キャプチャ後、各画像の名前を、ルートパーツの実際のポストアセンブラージュを許可するコードに変更します。プレゼンテーションソフトウェアを使用して、画像アセンブリの製図板を設計し、幅を画像の幅より2〜3センチメートル広く設定します。
15 枚の画像をキャプチャした後、1 つのセグメントからキャプチャしたすべての画像をキャプチャの順序で 1 から 15 まで追加し、ルート セグメントの全長を再構築します。次に、垂直方向の配置を使用して画像を中央に配置し、各画像が前の画像に従うようにします。ルートセグメント全体をカバーするように、すべての画像に10 x 150セルのグリッドを配置します。
さらに、各画像とこのグリッドのすべてのセルに10 x 10のグリッドを配置し、アーバスキュラー菌根またはAM構造が表示されている場合は1から6までの数字を挿入し、AM構造が存在しない場合は空白のままにします。幅 10 セル、長さ 150 セルのグリッドの表を追加します。寸法の表を画像の幅に変更してから、すべての画像で構成されるように表の長さを変更します。
菌根コロニー形成をスコアリングするには、菌根パターン法で説明されているように、一意の番号を使用して各タイプの構造をスコアリングします。菌糸に1つ、アーバスキュルに2つ、小胞に3つ、胞子に4つ、補助細胞に5つ、エントリポイントに6つを使用します。以前に適用されたグリッドの各細胞から観察された各菌根構造をスコアリングする。
スコアリング後、取得したすべてのスコアをMycoPattスプレッドシートに挿入します。コピーペースト機能を使用して、プレゼンテーションのすべてのスコアを「生データ」という名前の最初のシートに転送します。一次分析では、[パラメーター] という名前の 3 番目のシートを使用して、結果を 3 つの形式で個別にパーセンテージとして視覚化します。
列AからKを使用して植民地化の水平画像を分析し、列MからWを使用して植民地化の垂直画像を分析し、列YからAIを使用して、15 10 x 10の正方形のそれぞれの横方向のコロニー形成と最終的な平均コロニー形成を分析します。次に、各パラメータに固有の定義と式を適用します。菌根マップの作成と抽出のために、菌根構造コードを色に変換して得られた画像をGraphsという名前の2番目のシートで視覚化します。
次に、グラフシートに結果の画像を画像としてエクスポートし、凡例のカラーコードを使用して菌根パターンを分析します。菌根マップ解析では、最も重要な構造とその集合体を特定します。次に、分析された根で観察された菌根コロニー形成パターンを記述し、続いて根で観察された構造発達、分岐パターン、およびアーバスキュラー小胞発達に基づくコロニー形成戦略を記述します。
このプロトコルは、菌根構造と根細胞の間の良好なコントラストを持つ菌根構造の詳細を提供します ゼアメイズとフェスタルルブラ.透明化と染色の手順の失敗により、フェスタルルブラとゼアメイの菌根構造の顕微鏡画像が不明瞭になりました。菌根コロニー形成パターンは、コロニー形成メカニズムの完全な探索を可能にし、この方法は、コロニー形成パラメータの追加の視覚的表現を伴うZea maysおよびFestuca rubraのコロニー形成パターンおよび戦略の深くて小規模な探索を提供する。
ゼアでは、植物の発育段階によって大きく変動するコロニー形成の可能性が観察されたが、フェストゥカルブラでは、コロニー形成過程が根の内部で起こり、菌糸網の発達は根の発達速度の低さと相関していた。MycoPattは、あらゆる植物におけるアーバスキュラー菌根コロニー形成のマッピングに適しています。また、コロニー形成メカニズムを十分に調査し、根に沿って真菌戦略を評価することも役立ちます。
