שיטת MycoPatt מאפשרת חקירה מעמיקה של התיישבות מיקוריזאלית ארבוסקולרית בשורשים. מפות מיקוריזאליות מצביעות על התפשטות פטרייתית ומציגות את המיקום האמיתי של כל מבנה כתבנית מסוימת. התיישבות מיקוריזאלית מנותחת באופן אובייקטיבי ברזולוציה של 1%.
כל מקטע שורש מומר אוטומטית למטריצה דיגיטלית ומייצר מסד נתונים נרחב של פרמטרי קולוניזציה. כדי להתחיל, להסיר את השורשים מהמקרר ומניחים אותם על משטח עבודה להפשרה בטמפרטורת החדר. כדי לבצע ניקוי שורשים, מניחים את כל השורשים מצמח אחד בצנצנת של 30 עד 50 מיליליטר, ואז מכינים תמיסת 10% נתרן הידרוקסידי עם מי ברז ויוצקים אותה לתוך הצנצנת עד שהיא מכסה לחלוטין את השורשים.
מנערים את הצנצנת במרץ במשך דקה עד שתיים לפיזור הומוגני של תמיסת ניקוי בשורשים. אפשרו לשורשים להישאר בפתרון הסליקה למשך 48 שעות. לשטיפת שורשים, מעבירים את תוכן הצנצנת דרך מסננת.
יש לשטוף את השורשים מספר פעמים במי ברז עד להסרתם המלאה של תמיסת הסליקה. לאחר מכן מניחים את השורשים השטופים בצנצנת נקייה להכתמה. לאחר מכן הכינו תמיסת חומץ דיו של חמישה עד חמישה אחוזים עם מי ברז.
יוצקים אותו לתוך הצנצנת עד שהוא מכסה את השורשים ומנערים אותו במשך דקה עד שתיים. לאחר 48 שעות להדחה חלקית, יש לשטוף את השורשים המוכתמים במי ברז למשך דקה עד שתי דקות. נערו את הצנצנת במרץ כדי להסיר את תמיסת הכתמים הנוספת.
חזור על ההליך עד שהשורשים ברורים להערכה מיקרוסקופית. לפילוח שורשים, הניחו את השורשים המוכתמים על קרש חיתוך מוקטן. חותכים את השורשים למקטעים של סנטימטר אחד.
בחר 15 מקטעים עבור כל גרסה. לאחר מכן, מורחים את השורשים על שקופית להכנת מקטעים, משתמשים בשקית למינציה כדי לכסות את השורשים ומרסקים אותם בעדינות, החל מקצה. השתמש בכלי פלסטיק רך כדי להציג את השורשים בשקופית.
הסר בזהירות את שקית הלמינציה וכסה את הדגימה בחלוק כיסוי. הוסיפו מים לפינת המגלשה בעזרת פיפטה, ותנו למים להתפשט באיטיות על המגלשה. מוציאים את המים הנוספים בעזרת מגבת נייר.
לניתוח מיקרוסקופי, השתמש במיקרוסקופ המצויד במצלמה ברזולוציה טובה. נתח את השקופיות החל מקיצוניות. צלם כל שדה מיקרוסקופי.
השתמש בהגדלה של 10 או 40x עבור שורשים עבים ופי 40 עבור שורשים דקים. לאחר הלכידה, שנה את שמה של כל תמונה עם קוד שיאפשר את ההרכבה האמיתית שלאחר ההרכבה של חלקי השורש. השתמש בתוכנת מצגות כדי לעצב לוח שרטוט להרכבת תמונות, הגדר את הרוחב שרוחבו שניים עד שלושה סנטימטרים מרוחב התמונה.
לאחר לכידת 15 תמונות, הוסף את כל התמונות שצולמו מקטע אחד לפי סדר הלכידתן, החל מאחת עד 15, ושחזר את כל אורך מקטע השורש. לאחר מכן, השתמש ביישור האנכי כדי ליישר את התמונות במרכז ולוודא שכל תמונה עוקבת אחר הקודמת. מקם רשת של 10 על 150 תאים על כל התמונות כדי לכסות את כל מקטע השורש.
בנוסף, מקם רשת של 10 על 10 בכל תמונה ובכל תא של רשת זו, הוסף מספר מאחד עד שישה אם מבנה מיקוריזאל או AM ארבוסקולרי גלוי, או השאר ריק אם אין מבנה AM. הוסף טבלה עבור רשת של 10 תאים ברוחב ו- 150 תאים באורך. שנו את הטבלה עם הממדים לרוחב התמונות, ואחר כך שנו את אורך הטבלה כך שתכלול את כל התמונות.
לניקוד התיישבות מיקוריזאלית, השתמש במספר הייחודי כדי להבקיע כל סוג של מבנה כמתואר בשיטת תבנית מיקוריזאל. השתמש באחד עבור hyphae, שניים עבור arbuscules, שלושה עבור שלפוחית, ארבעה עבור נבגים, חמישה עבור תאי עזר, ושש עבור נקודות כניסה. ניקוד כל אחד מהם נצפה במבנה מיקוריזאלי מכל תא ברשתות שהוחלו קודם לכן.
לאחר הניקוד, הכנס את כל הציונים שהתקבלו לגיליון האלקטרוני של MycoPatt. השתמש בפונקציית העתק הדבק כדי להעביר את כל התוצאות מהמצגת לגיליון הראשון בשם Raw Data. עבור הניתוח הראשי, השתמש בגיליון השלישי בשם פרמטרים כדי להציג באופן חזותי את התוצאות כאחוזים בנפרד בשלוש צורות.
השתמש בעמודות A עד K כדי לנתח את התמונה האופקית של הקולוניזציה, בעמודות M עד W עבור התמונה האנכית של הקולוניזציה, ובעמודות Y ל- AI כדי לנתח את הקולוניזציה הרוחבית עבור כל אחד מ- 15 10 על 10 ריבועים והקולוניזציה הממוצעת הסופית. לאחר מכן, החל את ההגדרות והנוסחאות הספציפיות לכל פרמטר. לייצור ומיצוי של מפות מיקוריזאליות, דמיינו את התמונה המתקבלת מהמרה של קוד מבנים מיקוריזאליים לצבעים בגיליון השני בשם גרפים.
לאחר מכן ייצא את התמונה המתקבלת בגיליון התרשים כתמונה והשתמש בקוד הצבע במקרא כדי לנתח תבניות מיקוריזאליות. לצורך ניתוח מפת מיקוריזאל, זהה את המבנים החשובים ביותר ואת המכלול שלהם. לאחר מכן תאר את דפוס ההתיישבות המיקוריזאלית שנצפתה בשורשים המנותחים, ולאחר מכן אסטרטגיית התיישבות המבוססת על התפתחות מבנית שנצפתה בשורש, תבנית ההסתעפות והתפתחות שלפוחית ארבוסקולרית.
פרוטוקול זה מספק את הפרטים של מבנים מיקוריזאליים עם ניגודיות טובה בין מבנים מיקוריזאליים ותאי שורש עבור Zea mays ו- Festal rubra. הליכי הניקוי וההכתמה הכושלים הביאו לתמונות מיקרוסקופיות לא ברורות של מבנים מיקוריזאליים ב-Festal rubra וב-Zea mays. דפוסי התיישבות מיקוריזאליים אפשרו חקירה מלאה של מנגנון הקולוניזציה, שיטה זו מספקת חקירה עמוקה בקנה מידה קטן של דפוסי קולוניזציה ואסטרטגיות עבור Zea mays ו- Festuca rubra עם ביטוי חזותי נוסף של פרמטרים קולוניזציה.
ב-Zea mays נצפתה תנודתיות גבוהה בפוטנציאל ההתיישבות בהתאם לשלב ההתפתחותי של הצמח, אולם ב-Festuca rubra תהליכי הקולוניזציה מתרחשים בתוך השורשים והתפתחות רשתות היפלים הייתה מתואמת עם מהירות התפתחות נמוכה של השורשים. MycoPatt מתאים למיפוי ההתיישבות המיקוריזאלית הארבוסקולרית בכל צמח. זה גם מועיל לחקור באופן מלא את מנגנון ההתיישבות ולהעריך אסטרטגיה פטרייתית לאורך השורשים.
