Метод MycoPatt позволяет глубоко исследовать арбускулярную микоризную колонизацию корней. Микоризные карты указывают на грибковое расширение и представляют реальное положение каждой структуры в виде определенного паттерна. Микоризная колонизация объективно анализируется при разрешении 1%.
Каждый корневой сегмент автоматически преобразуется в цифровую матрицу и генерирует обширную базу данных параметров колонизации. Для начала извлеките корни из холодильника и поместите их на рабочую площадку для размораживания при комнатной температуре. Чтобы выполнить очистку корней, поместите все корни одного растения в банку от 30 до 50 миллилитров, затем приготовьте 10%-ный раствор гидроксида натрия с водопроводной водой и вылейте его в банку, пока он полностью не покроет корни.
Энергично встряхните банку в течение одной-двух минут для однородной дисперсии очищающего раствора в корнях. Дайте корням остаться в очищающем растворе в течение 48 часов. Для промывки корней пропустите содержимое банки через сито.
Промойте корни несколько раз в водопроводной воде до полного удаления очищающего раствора. Далее поместите промытые корни в чистую банку для окрашивания. Затем приготовьте пяти-пятипроцентный раствор чернильного уксуса с водопроводной водой.
Вылейте его в банку, пока он не покроет корни, и встряхните его в течение одной-двух минут. Через 48 часов для частичного обезжиривания промойте окрашенные корни в водопроводной воде на одну-две минуты. Энергично встряхните банку, чтобы удалить лишний раствор для окрашивания.
Повторяйте процедуру до тех пор, пока корни не станут прозрачными для микроскопической оценки. Для сегментации корней поместите окрашенные корни на чешуйчатую разделочную доску. Нарежьте корни на сантиметровые сегменты.
Выберите 15 сегментов для каждого варианта. Далее выкладываем корни на горку для подготовки сегмента, используйте ламинирующий мешочек для покрытия корней и аккуратно измельчайте их, начиная с края. Используйте мягкий пластиковый инструмент для отображения корней на слайде.
Аккуратно снимите ламинирующий мешочек и накройте образец крышкой. Добавьте воду в угол горки с помощью пипетки и дайте воде медленно распределиться по горке. Удалите лишнюю воду бумажным полотенцем.
Для микроскопического анализа используйте микроскоп, оснащенный камерой хорошего разрешения. Анализируйте слайды, начиная с конечности. Захватите каждое микроскопическое поле.
Используйте 10 или 40-кратное увеличение для толстых корней и 40-кратное для тонких корней. После захвата переименуйте каждое изображение с помощью кода, который позволит реальную пост-ассамбляж корневых частей. Используйте презентационное программное обеспечение для проектирования чертежной доски для сборки изображений, установите ширину на два-три сантиметра шире ширины изображения.
После захвата 15 снимков добавьте все захваченные изображения из одного сегмента в порядке их захвата, начиная с одного до 15, и реконструируйте всю длину корневого сегмента. Затем используйте вертикальное выравнивание, чтобы выровнять изображения по центру и убедиться, что каждое изображение следует за предыдущим. Поместите сетку из 10 на 150 ячеек на все изображения, чтобы покрыть весь корневой сегмент.
Кроме того, поместите сетку 10 на 10 на каждом изображении и в каждую ячейку этой сетки вставьте число от одного до шести, если видна арбускулярная микоризная или AM-структура, или оставьте пустым, если структура AM отсутствует. Добавьте таблицу для сетки шириной 10 ячеек и длиной 150 ячеек. Измените таблицу с размерами на ширину изображений, а затем измените длину таблицы, чтобы она включала все изображения.
Для оценки микоризной колонизации используйте уникальный номер для оценки каждого типа структуры, как описано в методе микоризного паттерна. Используйте один для гиф, два для арбускул, три для везикул, четыре для спор, пять для вспомогательных клеток и шесть для точек входа. Оцените каждую наблюдаемую микоризную структуру из каждой клетки ранее нанесенных сеток.
После подсчета баллов вставьте все полученные оценки в таблицу MycoPatt. Используйте функцию копирования вставки для переноса всех оценок из презентации на первый лист с именем Raw Data. Для первичного анализа используйте третий лист с именем Параметры для визуализации результатов в процентах отдельно в трех формах.
Используйте столбцы от A до K для анализа горизонтального изображения колонизации, столбцы от M до W для вертикального изображения колонизации и столбцы от Y до AI для анализа поперечной колонизации для каждого из 15 квадратов 10 на 10 и окончательной средней колонизации. Затем примените определения и формулы, специфичные для каждого параметра. Для получения и извлечения микоризных карт визуализируйте изображение, полученное в результате преобразования кода микоризных структур в цвета на втором листе под названием Graphs.
Затем экспортируйте полученное изображение в лист графика в виде изображения и используйте цветовой код в легенде для анализа микоризных узоров. Для анализа микоризной карты определите наиболее важные структуры и их сборку. Затем опишите паттерн микоризной колонизации, наблюдаемый в анализируемых корнях, за которым следует стратегия колонизации, основанная на наблюдаемом структурном развитии в корне, ветвящемся паттерне и развитии арбускулярных пузырьков.
Этот протокол предоставляет детали микоризных структур с хорошим контрастом между микоризными структурами и корневыми клетками для Zea mays и Festal rubra. Неудачные процедуры очистки и окрашивания привели к неясным микроскопическим изображениям микоризных структур в Festal rubra и Zea mays. Модели микоризной колонизации позволили полностью исследовать механизм колонизации, этот метод обеспечивает глубокое, мелкомасштабное исследование моделей и стратегий колонизации для Zea mays и Festuca rubra с дополнительным визуальным выражением параметров колонизации.
В Zea mays наблюдался сильно колеблющийся колонизационный потенциал в зависимости от стадии развития растения, однако у Festuca rubra процессы колонизации происходили внутри корней и развитие гифальных сетей коррелировало с низкой скоростью развития корней. MycoPatt подходит для картирования арбускулярной микоризной колонизации у любого растения. Также полезно полностью изучить механизм колонизации и оценить грибковую стратегию вдоль корней.
