MycoPatt方法允许深入探索根系丛枝菌根定植。菌根图指向真菌扩张,并将每个结构的真实位置呈现为特定模式。以1%的分辨率客观分析菌根定植。
每个根段都自动转换为数字矩阵,并生成一个广泛的定植参数数据库。首先,从冰箱中取出根部并将它们放在工作平台上以在室温下解冻。要进行根部清理,请将一株植物的所有根放入 30 至 50 毫升的罐子中,然后用自来水准备 10% 氢氧化钠溶液并将其倒入罐中,直到完全覆盖根部。
用力摇晃罐子一到两分钟,使清除溶液均匀分散在根部。让根在澄清溶液中保留 48 小时。对于根冲洗,将罐子的内容物通过筛子。
用自来水冲洗根部几次,直到完全去除清除溶液。接下来,将冲洗过的根放入干净的罐子中进行染色。然后用自来水准备百分之五到百分之五的墨水醋溶液。
将其倒入罐中,直到覆盖根部并摇晃一到两分钟。部分脱色 48 小时后,用自来水冲洗染色的根部一到两分钟。用力摇晃罐子以去除多余的染色溶液。
重复该过程,直到根部清除以进行显微镜评估。对于根分割,将染色的根放在有比例的砧板上。将根切成一厘米的段。
为每个款式/规格选择 15 个细分。接下来,将根部铺在载玻片上进行分段准备,使用层压袋覆盖根部并从边缘开始轻轻压碎它们。使用软塑料工具在幻灯片上显示根部。
小心地取出层压袋,并用盖玻片盖住样品。用移液管将水添加到载玻片的一角,让水慢慢扩散到载玻片上。用纸巾擦去多余的水。
对于显微分析,请使用配备良好分辨率相机的显微镜。从四肢开始分析幻灯片。捕获每个微观场。
粗根使用 10 或 40 倍放大倍率,细根使用 40 倍放大倍率。捕获后,使用允许根部分的真正后组装的代码重命名每个图像。使用演示软件设计用于图像组合的绘图板,将宽度设置为比图像宽度宽两到三厘米。
捕获 15 张照片后,按捕获顺序(从 1 到 15)将一个段中的所有捕获图像相加,并重建根段的整个长度。接下来,使用垂直对齐将图像对齐到中心,并确保每个图像都遵循前一个图像。在所有图片上放置一个 10 x 150 个单元格的网格以覆盖整个根段。
此外,在每张图片上和此网格的每个单元格中放置一个 10 x 10 的网格,如果可见丛枝菌根或 AM 结构,则插入一个从 1 到 6 的数字,如果没有 AM 结构,则留空。为宽度为 10 个单元格、长度为 150 个单元格的网格添加一个表格。将带有尺寸的表格更改为图像的宽度,然后更改表格的长度以包含所有图像。
要对菌根定植进行评分,请使用唯一编号对每种类型的结构进行评分,如菌根模式方法中所述。菌丝用一个,丛枝用两个,囊泡用三个,孢子用四个,辅助细胞用五个,入口点用六个。对先前应用的网格的每个单元格的每个观察到的菌根结构进行评分。
评分后,将所有获得的分数插入MycoPatt电子表格。使用复制粘贴功能将所有分数从演示文稿传输到名为"原始数据"的第一张工作表中。对于主要分析,请使用名为"参数"的第三个工作表以三种形式分别以百分比形式将结果可视化。
使用 A 到 K 列分析定植的水平图像,使用 M 到 W 列分析定植的垂直图像,使用 Y 到 AI 列分析 15 个 10 x 10 方块中每个方块的横向定植和最终平均定植。接下来,应用特定于每个参数的定义和公式。对于菌根图的生成和提取,请在名为 Graph 的第二张工作表中可视化通过菌根结构代码转换为颜色获得的图像。
然后将图表中的结果图像导出为图像,并使用图例中的颜色代码分析菌根模式。对于菌根图谱分析,请确定最重要的结构及其组合。然后描述在分析的根中观察到的菌根定植模式,然后根据观察到的根结构发育、分支模式和丛枝囊泡发育的定植策略。
该协议提供了菌根结构的详细信息,菌根结构和根细胞之间的良好对比,用于Zea mays和Festal rubra。不成功的清除和染色程序导致红节和Zea mays中菌根结构的显微图像不清晰。菌根定植模式允许对定植机制进行完整的探索,该方法为Zea mays和Festuca rubra的定植模式和策略提供了深入,小规模的探索,并增加了定植参数的视觉表达。
在Zea中,观察到根据植物的发育阶段高度波动的定植潜力,然而,在Festuca rubra中,定植过程发生在根部内部,菌丝网络的发育与根的低发育速度相关。MycoPatt适用于绘制任何植物丛枝菌根定植的图谱。充分探索定植机制和评估沿根的真菌策略也是有帮助的。