Este protocolo permite la fabricación conveniente de microgeles de quitosano sin disolventes tóxicos que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos y administración de fármacos. Esta técnica no requiere equipos especiales o capacitación y no requiere técnicas de emulsión tóxica o enjuagues con solventes, lo que la hace altamente biocompatible y traducible a un entorno clínico. Hemos aplicado esta técnica como una estrategia de biomaterial para tratar las lesiones de la placa de crecimiento.
Sin embargo, creemos que esta técnica también será útil en otras aplicaciones de medicina regenerativa. Esta técnica se puede aplicar a otras aplicaciones de medicina regenerativa que se beneficiarían de un sistema de andamio de biomateriales inyectables, biodegradables y con el potencial de liberación sostenida de fármacos. Comience agregando ácido acético y quitosano purificado a una jeringa de bloqueo Luer de 10 mililitros para formar una solución de quitosano al 6% peso por volumen.
Usando un conector de bloqueo Luer hembra hembra, conecte dos jeringas de bloqueo Luer, luego mezcle la solución hacia adelante y hacia atrás hasta que el quitosano se haya disuelto completamente en el ácido ascético. Ahora agregue 100 microlitros de la solución de genipina a la jeringa que contiene quitosano y mezcle de un lado a otro entre las jeringas durante 30 segundos, luego expulse la mezcla de la jeringa a una placa de Petri de 35 milímetros. Cubra la placa de Petri con película de parafina e incube a 37 grados centígrados durante la noche en una atmósfera humidificada.
Use una espátula para romper el hidrogel en trozos más pequeños, luego coloque un filtro del tamaño de malla deseado en la parte posterior de una jeringa limpia de 10 mililitros. Transfiera las piezas de gel rotas a la jeringa equipada con el filtro y agregue 6 mililitros de agua destilada doble. Conecte la jeringa a través de un conector de bloqueo Luer a otra jeringa limpia de 10 milímetros.
Forzar la mezcla de gel y agua a través de la jeringa con el filtro para crear microgeles. Después de la primera filtración, abra la jeringa que contiene el filtro y vuelva a agregar la mezcla a esta jeringa. Forzar la mezcla a través del filtro de nuevo.
Ahora, transfiera la mezcla de gel filtrado a un tubo cónico de 50 mililitros y agregue agua destilada doble para llevar el volumen a 20 mililitros. Vórtice la solución para obtener una solución homogénea. Centrifugar los microgeles a 100 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Después de la centrifugación, retire la fase acuosa superior y resuspenda los microgeles en 10 mililitros de etanol al 70%, luego vórtice los microgeles y colóquelos bajo luz UV durante una hora para esterilizarlos. Ahora, centrifuga los microgeles a 1000 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deseche el etanol y enjuague 3 veces con agua destilada doble.
Resuspendir los gránulos de microgel en un volumen igual de agua destilada doble. Con el aumento en el pH, los microgeles mostraron una disminución en la hinchazón como se muestra por el cambio en el diámetro de Feret. Además, el tamaño de las partículas de microgel depende del tamaño de los poros del filtro utilizado.
La malla número 200 produjo partículas pequeñas, mientras que la malla número 100 dio lugar a partículas grandes. La presencia de microgeles en el sitio lesionado promovió la regeneración del cartílago. La tinción de hematoxilina azul alciano mostró que los microgeles inyectados en el tejido lesionado previnieron la formación temprana de barras óseas y los microgeles cargados con agentes bioactivos SDF-1a y TGF-B3 promovieron la formación de cartílago.
Es importante asegurarse de que el filtro de malla de alambre se coloque correctamente en la jeringa para que se pueda realizar un filtrado efectivo. También es importante repetir la filtración varias veces para asegurar una distribución homogénea del tamaño del microgel. Estos microgeles se pueden aplicar a una amplia variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos que requieren un sustrato de andamio de biomaterial que tenga el potencial de liberación sostenida de terapias.
