ייצור של מיקרוג'לים צ'יטוזן-גניפינים מבוקרי גודל ונטולי תחליב ליישומים של הנדסת רקמות

פרוטוקול זה מאפשר ייצור נוח של מיקרוג'לים צ'יטוזן ללא ממסים רעילים שיכולים לשמש למגוון יישומי הנדסת רקמות ואספקת תרופות. טכניקה זו אינה דורשת ציוד או אימון מיוחד ואינה דורשת טכניקות תחליב רעילות או שטיפות ממס, מה שהופך אותה להתאמה ביולוגית גבוהה וניתנה לתרגום למסגרת קלינית. יישמנו טכניקה זו כאסטרטגיה של חומר ביולוגי לטיפול בפציעות של לוחות גדילה.

עם זאת, אנו מאמינים כי טכניקה זו תהיה שימושית גם ביישומים אחרים של רפואה רגנרטיבית. ניתן ליישם טכניקה זו על יישומים אחרים של רפואה רגנרטיבית אשר ייהנו ממערכת פיגומים ביולוגית הניתנת להזרקה, מתכלה, עם פוטנציאל לשחרור תרופתי מתמשך. התחילו בהוספת חומצה אצטית וצ'יטוזן מטוהר למזרק מנעול לואר 10 מיליליטר כדי ליצור תמיסת צ'יטוזן במשקל של 6%.

באמצעות מחבר נעילת לואר נקבה נקבה, חברו שני מזרקי מנעול לואר, ואז ערבבו את התמיסה קדימה ואחורה עד שהצ'יטוזן פנימה נמס במלואו בחומצה הסגפנית. כעת מוסיפים 100 מיקרוליטרים של תמיסת הגניפין למזרק המכיל צ'יטוזן ומערבבים קדימה ואחורה בין המזרקים למשך 30 שניות, ואז פולטים את התערובת מהמזרק לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ. מכסים את צלחת הפטרי בסרט פרפין ומדגרים אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה באווירה לחה.

השתמשו במרית כדי לשבור את ההידרוג'ל לחתיכות קטנות יותר, ואז הניחו מסנן של גודל הרשת הרצוי לתוך גבו של מזרק נקי של 10 מיליליטר. מעבירים את חתיכות הג'ל השבורות למזרק המצויד במסנן ומוסיפים 6 מיליליטרים של מים מזוקקים כפולים. חברו את המזרק באמצעות מחבר נעילת Luer למזרק 10 מילימטר נקי אחר.

דחפו את תערובת הג'ל והמים דרך המזרק עם המסנן כדי ליצור מיקרוג'לים. לאחר הסינון הראשון, פתחו את המזרק המכיל את המסנן והוסיפו את התערובת בחזרה למזרק זה. דחפו את התערובת שוב דרך המסנן.

כעת, מעבירים את תערובת הג'ל המסוננת לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ומוסיפים מים מזוקקים כפולים כדי להביא את הנפח ל-20 מיליליטר. וורטקס את הפתרון כדי לקבל פתרון הומוגני. צנטריפוגה המיקרוגלים ב 100 פעמים גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר צנטריפוגה, הסר את הפאזה המימית העליונה והחזיר את המיקרוג'לים ל-10 מיליליטרים של 70% אתנול, ולאחר מכן סובבו את המיקרוג'לים והניחו אותם תחת אור UV למשך שעה אחת כדי לעקר אותם. כעת, צנטריפוגות המיקרוג'לים ב 1000 פעמים גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את האתנול ולשטוף 3 פעמים במים מזוקקים כפולים.

יש להחיות את כדורי המיקרוגל בנפח שווה של מים מזוקקים כפולים. עם העלייה ב- pH, המיקרוגלים הראו ירידה בנפיחות כפי שמתואר על ידי השינוי בקוטר ה-Feret. כמו כן, גודלם של חלקיקי המיקרוג'ל תלוי בגודל הנקבוביות של המסנן שבו נעשה שימוש.

מספר 200 רשת יצר חלקיקים קטנים, בעוד שמספר 100 רשת הוליד חלקיקים גדולים. הימצאותם של מיקרוג'לים באתר הפצוע קידמה את התחדשות הסחוס. צביעת המטוקסילין כחולה אלקיאנית הראתה כי מיקרוגלים שהוזרקו לרקמה הפצועה מנעו היווצרות מוטות גרמיים מוקדמת, ומיקרוג'לים עמוסים בחומרים ביו-אקטיביים SDF-1a ו-TGF-B3 קידמו את היווצרות הסחוס.

חשוב לוודא כי מסנן רשת החוטים ממוקם כראוי לתוך המזרק, כך שניתן יהיה לבצע סינון יעיל. חשוב גם לחזור על הסינון כמה פעמים כדי להבטיח התפלגות הומוגנית של גודל המיקרוג'ל. מיקרוג'לים אלה יכולים להיות מיושמים על מגוון רחב של יישומים הנדסיים של רקמות הדורשים מצע פיגום ביו-חומרי שיש לו פוטנציאל לשחרור מתמשך של טיפולים.