Este protocolo permite a fabricação conveniente de microgéis chitosanos sem solventes tóxicos que podem ser usados para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e entrega de medicamentos. Esta técnica não requer equipamento especial ou treinamento e não requer técnicas tóxicas de emulsão ou enxágues solventes, tornando-a altamente biocompatível e traduzível para um ambiente clínico. Aplicamos essa técnica como uma estratégia biomaterial para o tratamento de lesões de placas de crescimento.
No entanto, acreditamos que essa técnica também será útil em outras aplicações de medicina regenerativa, também. Esta técnica pode ser aplicada a outras aplicações de medicina regenerativa que se beneficiariam de um sistema de andaimes injetáveis, biodegradáveis e biomateriais com potencial para liberação sustentada de medicamentos. Comece adicionando ácido acético e chitosan purificado a uma seringa de bloqueio Luer de 10 mililitros para formar uma solução chitosana de peso por volume de 6%.
Usando um conector de bloqueio Luer fêmea fêmea, conecte duas seringas de bloqueio Luer, em seguida, misture a solução para frente e para trás até que o chitosan em tenha totalmente dissolvido no ácido ascético. Agora adicione 100 microliters da solução genipin à seringa contendo quitosan e misture para frente e para trás entre as seringas por 30 segundos, em seguida, ejete a mistura da seringa em uma placa de Petri de 35 milímetros. Cubra a placa de Petri com filme de parafina e incuba-o a 37 graus Celsius durante a noite em uma atmosfera umidificada.
Use uma espátula para quebrar o hidrogel em pedaços menores e, em seguida, coloque um filtro do tamanho da malha desejada na parte de trás de uma seringa limpa de 10 mililitros. Transfira as peças de gel quebradas para a seringa equipada com o filtro e adicione 6 mililitros de água dupla destilada. Conecte a seringa através de um conector de travar Luer a outra seringa limpa de 10 milímetros.
Force a mistura de gel e água através da seringa com o filtro para criar microgels. Após a primeira filtragem, abra a seringa contendo o filtro e adicione a mistura de volta nesta seringa. Force a mistura através do filtro novamente.
Agora, transfira a mistura de gel filtrada para um tubo cônico de 50 mililitros e adicione água dupla destilada para levar o volume a 20 mililitros. Vortex a solução para obter uma solução homogênea. Centrifugar os microgel a 100 vezes g por 5 minutos em temperatura ambiente.
Após a centrifugação, remova a fase aquosa superior e resuspenja os microgel em 10 mililitros de 70% de etanol, em seguida, vórtice dos microgésis e coloque-os sob luz UV por uma hora para esterilizar. Agora, centrifugar os microgels a 1000 vezes g por 5 minutos em temperatura ambiente. Descarte o etanol e enxágue 3 vezes com água dupla destilada.
Resuspenda as pelotas de microgel em um volume igual de água dupla destilada. Com o aumento do pH, os microgésis apresentaram queda no inchaço, como descrito pela mudança no diâmetro de Feret. Além disso, o tamanho das partículas de microgel depende do tamanho dos poros do filtro utilizado.
A malha número 200 produziu pequenas partículas, enquanto a malha número 100 deu origem a grandes partículas. A presença de microgésis no local ferido promoveu a regeneração da cartilagem. A coloração de hematoxilina azul alciano mostrou que microgelados injetados no tecido ferido impediram a formação precoce de barras ósseas e microgésis carregados com agentes bioativos SDF-1a e TGF-B3 promoveram a formação da cartilagem.
É importante garantir que o filtro de malha de arame seja colocado corretamente na seringa para que uma filtragem eficaz possa ocorrer. Também é importante repetir a filtragem algumas vezes para garantir uma distribuição homogênea do tamanho do microgel. Esses microgéis podem ser aplicados a uma grande variedade de aplicações de engenharia de tecidos que requerem um substrato de andaimes biomaterial que tem o potencial de liberação sustentada de terapêuticas.
