Этот протокол позволяет удобно изготавливать микрогели хитозана без токсичных растворителей, которые могут быть использованы для различных применений тканевой инженерии и доставки лекарств. Этот метод не требует специального оборудования или обучения и не требует методов токсической эмульсии или полосканий растворителями, что делает его высоко биосовместимым и переводимым в клинических условиях. Мы применили эту технику в качестве биоматериальной стратегии для лечения травм пластин роста.
Тем не менее, мы считаем, что этот метод также будет полезен в других применениях регенеративной медицины. Этот метод может быть применен к другим применениям регенеративной медицины, которые выиграют от инъекционной, биоразлагаемой системы каркасов биоматериала с потенциалом для устойчивого высвобождения лекарств. Начните с добавления уксусной кислоты и очищенного хитозана в 10-миллилитровый шприц Luer lock, чтобы сформировать 6% раствор хитозана для веса по объему.
Используя женский разъем замка Luer, соедините два шприца Luer Lock, затем перемешайте раствор вперед и назад, пока хитозан полностью не растворится в аскетической кислоте. Теперь добавьте 100 микролитров раствора генипина к шприцу, содержащему хитозан, и перемешайте между шприцами в течение 30 секунд, затем выбросьте смесь из шприца на 35-миллиметровую чашку Петри. Накройте чашку Петри парафиновой пленкой и высиживайте ее при 37 градусах Цельсия в течение ночи во увлажненной атмосфере.
Используйте шпатель, чтобы разбить гидрогель на более мелкие кусочки, затем поместите фильтр нужного размера сетки в заднюю часть чистого 10-миллилитрового шприца. Переложите сломанные кусочки геля в шприц, оснащенный фильтром, и добавьте 6 миллилитров двойной дистиллированной воды. Подключите шприц через разъем замка Luer к другому чистому 10-миллиметровому шприцу.
Протолкните смесь геля и воды через шприц с фильтром для создания микрогелей. После первой фильтрации откройте шприц, содержащий фильтр, и добавьте смесь обратно в этот шприц. Снова протолкните смесь через фильтр.
Теперь переложите отфильтрованную гелевую смесь в 50-миллилитровую коническую трубку и добавьте двойную дистиллированную воду, чтобы довести объем до 20 миллилитров. Вихрь раствора для получения однородного раствора. Центрифугировать микрогели по 100 раз в г в течение 5 минут при комнатной температуре.
После центрифугирования удалите верхнюю водную фазу и повторно суспендируйте микрогели в 10 миллилитрах 70% этанола, затем вихрьте микрогели и поместите их под ультрафиолетовый свет на один час для стерилизации. Теперь центрифугируйте микрогели в 1000 раз в г в течение 5 минут при комнатной температуре. Выбросьте этанол и промыть 3 раза двойной дистиллированной водой.
Повторно суспендировать микрогелевые гранулы в равном объеме двойной дистиллированной воды. С увеличением рН микрогели показали уменьшение отека, как показано изменением диаметра Ферета. Кроме того, размер частиц микрогеля зависит от размера пор используемого фильтра.
Число 200 сетки производило мелкие частицы, в то время как число 100 сетки давало начало крупным частицам. Наличие микрогелей на поврежденном участке способствовало регенерации хряща. Окрашивание альциановым синим гематоксилином показало, что микрогели, введенные в поврежденную ткань, предотвращали раннее образование костного стержня, а микрогели, загруженные биологически активными агентами SDF-1a и TGF-B3, способствовали образованию хряща.
Важно убедиться, что фильтр проволочной сетки правильно помещен в шприц, чтобы могла иметь место эффективная фильтрация. Также важно повторить фильтрацию несколько раз, чтобы обеспечить однородное распределение микрогелевого размера. Эти микрогели могут быть применены к широкому спектру применений тканевой инженерии, которые требуют субстрата биоматериала, который имеет потенциал для устойчивого высвобождения терапевтических средств.
