このプロトコルは、様々な組織工学および薬物送達用途に使用することができる毒性溶媒を含まないキトサンミクロゲルの便利な製造を可能にする。この技術は、特別な装置やトレーニングを必要とせず、有毒なエマルジョン技術や溶剤リンスを必要とせず、生体適合性が高く、臨床現場に翻訳可能です。我々は、この技術を成長プレート損傷を治療するための生体材料戦略として適用した。
しかし、この技術は他の再生医療用途にも役立つと考えています。この技術は、持続的な薬物放出の可能性を秘めた注射可能、生分解性、生体材料足場システムの恩恵を受ける他の再生医療用途に適用することができる。まず、酢酸と精製キトサンを10ミリリットルのルアーロックシリンジに添加し、体積重量6%のキトサン溶液を形成します。
メスメスルアーロックコネクタを使用して、2つのルアーロックシリンジを接続し、キトサンが禁欲酸に完全に溶解するまで溶液を前後に混合する。次に、100マイクロリットルのゲニピン溶液をキトサン含有シリンジに加え、シリンジ間を30秒間前後に混合し、次いで混合物をシリンジから35ミリメートルのペトリ皿に排出する。ペトリ皿をパラフィンフィルムで覆い、加湿された雰囲気の中で一晩摂氏37度でインキュベートする。
ヘラを使用してヒドロゲルをより小さな断片に分解し、所望のメッシュサイズのフィルターを清潔な10ミリリットルシリンジの背面に置く。壊れたゲル片をフィルターを取り付けたシリンジに移し、6ミリリットルの二重蒸留水を加える。ルアーロックコネクタを介してシリンジを別の清潔な10ミリメートルシリンジに接続します。
ゲルと水の混合物をフィルター付きのシリンジに強制的に通し、ミクロゲルを作成します。最初のろ過の後、フィルターを含むシリンジを開き、混合物をこのシリンジに戻します。混合物を再びフィルターを通して強制する。
次に、濾過したゲル混合物を50ミリリットルの円錐管に移し、二重蒸留水を加えて体積を20ミリリットルにする。溶液を渦巻き、均一な溶液を得る。ミクロゲルを室温で5分間、100倍gで遠心分離する。
遠心分離後、上部水相を除去し、ミクロゲルを10ミリリットルの70%エタノールに再懸濁し、次いでミクロゲルをボルテックスし、UV光下に1時間置いて滅菌する。次に、ミクロゲルを室温で5分間、1000倍gで遠心分離する。エタノールを捨て、二重蒸留水で3回すすいでください。
ミクロゲルペレットを等量の二重蒸留水に再懸濁する。pHの上昇に伴い、ミクロゲルは、フェレ径の変化によって示されるように膨潤の減少を示した。また、ミクロゲル粒子の大きさは、使用するフィルターの孔径に依存する。
200メッシュは小さな粒子を生成し、100メッシュは大きな粒子を生み出しました。損傷部位におけるミクロゲルの存在は、軟骨再生を促進した。アルシアンブルーヘマトキシリン染色は、損傷組織に注射されたミクロゲルが早期の骨棒形成を予防し、生理活性物質SDF−1aおよびTGF−B3を装填したミクロゲルが軟骨形成を促進することを示した。
効果的なフィルタリングが行われるように、金網フィルターがシリンジに正しく配置されていることを確認することが重要です。ミクロゲルサイズの均質な分布を確保するために、ろ過を数回繰り返すことも重要です。これらのミクロゲルは、治療薬の持続放出の可能性を秘めた生体材料足場基材を必要とする多種多様な組織工学用途に適用することができる。
