Nuestro método responde a preguntas clave, como ¿cuál es la carga total de bacterias resistentes a los antibióticos en la muestra de agua? ¿Cuál es la identidad de estas bacterias y cuáles son los diferentes tipos de rasgos y genes resistentes a los antibióticos que portan? La ventaja de nuestro protocolo es que puede detectar incluso bacterias que no se pueden cultivar en el laboratorio, que constituyen una proporción significativa del total de bacterias en la muestra de agua.
Por lo tanto, teóricamente, ninguna bacteria o sus rasgos resistentes quedan fuera. Esta técnica combinatoria que involucra técnicas basadas en cultivo e independientes de cultivo se puede replicar y personalizar para cualquier muestra obtenida de aguas residuales, efluencia farmacéutica u hospitalaria, entornos clínicos y no clínicos, y más. Junto con Devika, demostrarán los procedimientos experimentales Harshali Shinde y Maitri Mishra, ambos becarios de investigación senior de mi laboratorio.
Para comenzar, procese la muestra de agua asépticamente filtrándola a través de un paño de muselina estéril para eliminar cualquier partícula. Luego, diluya en serie la muestra de agua filtrada para su posterior análisis. Para determinar la carga bacteriana total, coloque 100 microlitros de las diluciones apropiadas de la muestra de agua filtrada en las placas y duplicados de agar R2A solidificados, y extienda uniformemente.
Incubar todas las placas de propagación de muestras a 35 a 37 grados centígrados durante 48 horas. Después del período de incubación, contar las colonias y expresar la carga bacteriana total en unidades formadoras de colonias por mililitro. Para determinar el recuento bacteriano resistente a los antibióticos, agregue los antibióticos por separado en tubos que contengan 20 mililitros de agar R2A fundido estéril modificado aproximadamente a 40 grados centígrados.
Agitar para mezclar uniformemente y verter sobre placas de Petri estériles antes de que el agar se solidifique. Para el control de calidad y para comprobar la eficacia de los antibióticos, extienda 100 microlitros de suspensión bacteriana sobre sus respectivas placas modificadas con agar R2A que contienen antibióticos. Incubar las placas a 35 a 37 grados centígrados durante 48 horas, y luego determinar el recuento bacteriano.
Para preparar la plantilla de ADN de los aislados para PCR, utilizando un palillo de dientes estéril, tome una sola colonia pura aislada del aislado que crece en una placa de Petri. Suspenda la colonia bacteriana en 100 microlitros de agua doble destilada estéril en un tubo de microcentrífuga y hierva en un baño de agua hirviendo o un baño seco durante 10 minutos a 100 grados centígrados. Centrifugar la suspensión a 10, 000 g durante dos minutos para granular los desechos y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga estéril fresco para usarlo como plantilla de ADN crudo.
Para amplificar la región V3 del gen 16S rRNA por PCR, prepare 40 microlitros de la mezcla de reacción en un tubo de PCR. Coloque el tubo en el bloque térmico y ejecute el programa apropiado en el termociclador de PCR. Para resolver y visualizar los amplicones de PCR, mezcle 10 microlitros del producto de PCR amplificado en dos microlitros de tampón de carga de gel 6x, y cargue esta mezcla en los pocillos de un gel de agarosa al 1,5% junto con una escalera de ADN pareada de 100 bases para estimar el tamaño de los amplicones.
Realice la electroforesis del gel en el tampón del tanque TAE a 80 a 100 voltios hasta que el tinte de seguimiento ejecute 3/4 del gel. Luego visualice las bandas de amplicón bajo un transiluminador UV. Para preparar el inóculo, inocular asépticamente una sola colonia aislada de resistencia a antibióticos purificada utilizando un bucle estéril en dos mililitros de caldo Luria-Bertani, o LB, sin ningún antibiótico e incubar a 37 grados centígrados a 80 rpm durante la noche.
Al día siguiente, agregue de 100 a 150 microlitros del cultivo cultivado durante la noche a dos mililitros de caldo LB fresco no selectivo e incube durante dos a cuatro horas hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0.4 a 0.5. Diluir la suspensión de cultivo recién cultivada utilizando solución salina estéril al 0,85% y mezclar suavemente para distribuir las células uniformemente para alcanzar una densidad de cultivo equivalente a 0,5 McFarland estándar. Dentro de los 15 minutos posteriores a la dilución, sumerja un hisopo de algodón estéril en el inóculo y retire el exceso de suspensión para evitar la inoculación excesiva de las placas.
Luego extienda el cultivo uniformemente en la placa de agar Mueller Hinton preparada, comenzando desde la parte superior y yendo y viniendo de borde a borde. Luego gire la placa 60 grados y comience a frotar nuevamente. Para colocar los discos antibióticos, use un fórceps esterilizado por llama y transfiera asépticamente los discos antibióticos a las placas de agar inoculadas.
Presione los discos suavemente para asegurar un nivel completo de contacto con el agar. Coloque el número apropiado de discos antibióticos en la placa de agar considerando el organismo, el antibiótico utilizado y el tamaño de la placa para evitar la superposición de las zonas de inhibición. Dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación del disco antibiótico, invierta las placas e incube a 37 grados centígrados durante la noche.
Al día siguiente, mida el diámetro de la zona de inhibición en milímetros e interprete de acuerdo con los valores de punto de ruptura dados por EUCAST. Se encontró que la carga bacteriana total en la muestra de agua era de 3.0 x 10 a la novena UFC / ml, y se encontró que la carga bacteriana resistente a los antibióticos era alta. Los aislados culturales de resistencia a antibióticos secuenciados pertenecían a la familia Enterobacteriaceae, siendo la mayoría Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae.
Además, también se identificaron bacterias oportunistas raras. Las pruebas de susceptibilidad a antibióticos por el método de difusión del disco mostraron un índice de resistencia a antibióticos múltiples de aproximadamente 0,2 para ocho aislados, lo que indica un alto grado de resistencia. Sin embargo, las especies de Comamonas y Arthrobacter no mostraron resistencia a ninguno de los antibióticos probados.
Los aislados cultivables revelaron la presencia de genes de resistencia a antibióticos que codifican los factores contra betalactámicos, trimetoprima y aminoglucósidos. El análisis metagenómico del ADN para la diversidad bacteriana total condujo a la identificación de 50 filos, lo que indica la alta diversidad bacteriana donde Proteobacteria era el filo más dominante, que consiste en las clases Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria y Gammaproteobacteria. A nivel de orden, Burkholderiales fue el más prevalente, perteneciente a la clase Betaproteobacteria.
A nivel general, Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium y Comamonas fueron algunas de las bacterias abundantes. El análisis de ADN metagenómico también reveló más genes de resistencia a los antibióticos. En este método, el paso de dilución en serie es crítico ya que cualquier error puede conducir a una interpretación incorrecta de la UFC total y la carga bacteriana resistente a los antibióticos.
Además, el diámetro de la zona de inhibición debe medirse cuidadosamente para interpretar correctamente si el aislado es resistente o sensible. Utilizando estos protocolos, además de la muestra de agua, se puede estudiar cualquier otra muestra, ya sea ambiental, alimentaria o clínica. Además, además de las bacterias, otras poblaciones microbianas en cualquier ecosistema también pueden estudiarse utilizando enfoques similares.
