השיטה שלנו עונה על שאלות מפתח, כגון מהו העומס הכולל של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה בדגימת המים? מהי זהותם של חיידקים אלה ומהם סוגים שונים של תכונות עמידות לאנטיביוטיקה וגנים שהם נושאים? היתרון של הפרוטוקול שלנו הוא שהוא יכול לזהות אפילו חיידקים שלא ניתן לגדל במעבדה, המהווים חלק משמעותי מסך החיידקים בדגימת המים.
לפיכך, תיאורטית, שום חיידק או תכונותיו העמידות לא נותרים בחוץ. טכניקה קומבינטורית זו המערבת טכניקות מבוססות תרבית ובלתי תלויות בתרבית ניתנת לשכפול ולהתאמה אישית עבור כל דגימה המתקבלת משפכים של שפכים, תרופות או בתי חולים, מסגרות קליניות ולא קליניות ועוד. יחד עם דוויקה, המדגימים את הליכי הניסוי יהיו הרשלי שינדה ומיטרי מישרה, שניהם עמיתי מחקר בכירים מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, לעבד את דגימת המים באופן אספטי על ידי סינון אותו דרך בד מוסלין סטרילי כדי להסיר כל חומר חלקיקי. לאחר מכן, דילל באופן סדרתי את דגימת המים המסוננים לניתוח נוסף. כדי לקבוע את עומס החיידקים הכולל, הניחו 100 מיקרוליטרים של הדילולים המתאימים של דגימת המים המסוננים על לוחות אגר R2A מוצקים וכפילויות, והתפזרו באופן שווה.
לדגום את כל לוחות התפשטות הדגימה ב 35 עד 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. לאחר תקופת הדגירה, סופרים את המושבות ומבטאים את עומס החיידקים הכולל ביחידות יוצרות מושבות למיליליטר. כדי לקבוע את ספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה, הוסיפו את האנטיביוטיקה בנפרד לצינורות המכילים 20 מיליליטר של אגר R2A מותך סטרילי ששונה בערך ב-40 מעלות צלזיוס.
מערבלים לערבב באופן שווה ויוצקים על צלחות פטרי סטריליות לפני שהאגר מתמצק. לבקרת איכות ולבדיקת יעילות האנטיביוטיקה, יש למרוח 100 מיקרוליטרים של תרחיף חיידקים על גבי האנטיביוטיקה המתאימה להם המכילה לוחות R2A אגר מעובדים. לדגור את הצלחות ב 35 עד 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, ולאחר מכן לקבוע את ספירת החיידקים.
כדי להכין את תבנית הדנ"א מהמבודדים עבור PCR, באמצעות קיסם סטרילי, קח מושבה טהורה מבודדת אחת של המבודד הגדל על צלחת פטרי. להשעות את מושבת החיידקים ב 100 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים סטריליים בצינור צנטריפוגה מיקרו להרתיח אותו באמבט מים רותחים או אמבטיה יבשה במשך 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה המתלה ב 10, 000 גרם במשך שתי דקות כדי לזרוק את הפסולת ולהעביר את supernatant לצינור microcentrifuge סטרילי טרי להשתמש כתבנית DNA גס.
כדי להגביר את אזור V3 של הגן 16S rRNA על ידי PCR, הכינו 40 מיקרוליטרים של תערובת התגובה בצינור PCR. הנח את הצינור בבלוק התרמי, והפעל את התוכנית המתאימה במחזור התרמי PCR. לפתרון והדמיה של אמפליקונים PCR, יש לערבב 10 מיקרוליטרים של מוצר ה-PCR המוגבר בשני מיקרוליטרים של מאגר העמסת ג'ל 6x, ולטעון תערובת זו לתוך בארות של ג'ל 1.5% אגרוז יחד עם סולם DNA מזווג של 100 בסיסים להערכת גודל האמפליקונים.
בצע אלקטרופורזה של הג'ל במאגר מיכל TAE ב 80 עד 100 וולט עד צבע המעקב פועל 3/4 של הג'ל. לאחר מכן דמיינו את רצועות האמפליקון תחת טרנס-אילומינטור UV. כדי להכין את האינוקולום, יש לחסן באופן אספטי מושבת עמידות לאנטיביוטיקה מטוהרת מבודדת אחת באמצעות לולאה סטרילית בשני מיליליטר של לוריא-ברטני, או LB, מרק ללא כל אנטיביוטיקה ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס ב-80 סל"ד למשך הלילה.
למחרת, הוסיפו 100 עד 150 מיקרוליטרים של התרבית שגדלה במשך הלילה לשני מיליליטרים של מרק LB טרי ולא סלקטיבי ודגרו במשך שעתיים עד ארבע שעות עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר תגיע ל-0.4 עד 0.5. דלל את מתלה התרבית שזה עתה גדל באמצעות תמיסת מלח סטרילית של 0.85% וערבב בעדינות כדי לפזר את התאים באופן שווה כדי להגיע לצפיפות תרבית שוות ערך לתקן מקפרלנד 0.5. תוך 15 דקות מרגע הדילול, טבלו צמר גפן סטרילי לתוך האינוקולום והסירו את ההשעיה העודפת כדי למנוע חיסון יתר של הצלחות.
לאחר מכן פזרו את התרבות באופן שווה על צלחת האגר של מולר הינטון המוכנה, החל מלמעלה והלאה מקצה לקצה. לאחר מכן סובב את הצלחת ב -60 מעלות, והתחל להתנדנד שוב. כדי למקם את הדיסקים האנטיביוטיים, השתמשו במלקחיים מעוקרים בלהבה והעבירו את הדיסקים האנטיביוטיים באופן אספטי על לוחות האגר המחוסנים.
לחץ על הדיסקים בעדינות כדי להבטיח רמה מלאה של מגע עם האגר. מקם את המספר המתאים של דיסקים אנטיביוטיים על צלחת אגר על ידי התחשבות באורגניזם האנטיביוטיקה בשימוש ואת גודל הצלחת כדי למנוע חפיפה של אזורי העיכוב. תוך 15 דקות מיישום הדיסק האנטיביוטי, הפכו את הצלחות ודגרו אותן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת, מדוד את אזור קוטר העיכוב במילימטרים ופרש אותו על פי ערכי נקודת השבירה שניתנו על ידי EUCAST. נמצא כי עומס החיידקים הכולל בדגימת המים הוא 3.0 x 10 עד ל-CFU/mL התשיעי, ועומס החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה נמצא גבוה. המבודדים התרבותיים של עמידות לאנטיביוטיקה שייכים למשפחת Enterobacteriaceae, כאשר רובם הם Escherichia coli ו-Klebsiella pneumoniae.
בנוסף, זוהו גם חיידקים אופורטוניסטיים נדירים. בדיקת הרגישות לאנטיביוטיקה בשיטת דיפוזיית דיסק הראתה מדד עמידות אנטיביוטית מרובה של כ-0.2 לשמונה מבודדים, מה שמעיד על רמה גבוהה של עמידות. עם זאת, המינים Comamonas ו-Arthrobacter לא הראו עמידות לאף אחת מהאנטיביוטיקה שנבדקה.
המבודדים הניתנים להתרבות חשפו את נוכחותם של גנים עמידים לאנטיביוטיקה המקודדים את הגורמים נגד בטא-לקטאם, טרימתופרים ואמינוגליקוזידים. ניתוח דנ"א מטגנומי עבור מגוון החיידקים הכולל הוביל לזיהוי של 50 phyla, מה שמצביע על המגוון החיידקי הגבוה שבו פרוטאובקטריה הייתה הגוף הדומיננטי ביותר, המורכב ממחלקות אלפאפרוטאובקטריה, בטאפרוטאובקטריה וגמפרוטאובקטריה. ברמת הסדר, Burkholderiales היה הנפוץ ביותר, השייך למעמד Betaproteobacteria.
ברמה הכללית, פסאודומונס, אצינטובקטריה, פדובקטריה, פרוסקובקטריום, לימנוביטנים, פלבובקטריום וקומונות היו חלק מהחיידקים השופעים. ניתוח הדנ"א המטגנומי חשף גם גנים נוספים של עמידות לאנטיביוטיקה. בשיטה זו, שלב הדילול הסדרתי הוא קריטי מכיוון שכל שגיאה עלולה להוביל לפרשנות שגויה של סך CFU ועומס החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה.
כמו כן, יש למדוד בזהירות את קוטר אזור העיכוב כדי לפרש נכון אם המבודד עמיד או רגיש. באמצעות פרוטוקולים אלה, מלבד דגימת מים, ניתן לחקור כל דגימה אחרת, בין אם סביבתית, מזון או קלינית. יתר על כן, מלבד חיידקים, ניתן לחקור אוכלוסיות מיקרוביות אחרות בכל מערכת אקולוגית באמצעות גישות דומות.
