Nuestro protocolo es significativo porque permite tanto la desreplicación rentable y oportuna de antibióticos conocidos sin el uso de equipos especializados. La principal ventaja de esta técnica es la personalización de plantillas. Esto significa que un individuo puede adaptar los genes de resistencia que desean incluir en su plantilla de biblioteca en función de su nivel deseado de especificidad de sustrato amplio o estrecho.
Por ejemplo, un beta-lactam está expresando plantilla de E.coli se puede preparar con el fin de permitir la desreplicación muy específica de beta-lactams y sus diversas subclases. Utilizando una técnica séptica, la pipeta 500 microlitros de catión ajustaron MHB de un depósito estéril en cada pozo de una placa estéril de pozo de 96 profundidades. Con las placas de deformación unitaria ARP o MARP preparadas, utilice un stick aplicador para inocular la placa de pozo de 96 profundidad de acuerdo con el mapa ARP o MARP.
Coloque una membrana de sellado transpirable en la superficie de la placa del pozo profundo e i incubarlo durante la noche a 37 grados Celsius, 250 RPM. Asegúrese de que no haya pozos contaminados. Con una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros de cada pozo de la placa de pozo profundo a una placa inferior redonda estéril de 96 pozos.
Agregue 100 microlitros de 50% de glicerol estéril en cada pozo y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Prepare al menos cinco placas de biblioteca. Cubra las placas con sellos de aluminio estériles y asegúrese de que cada pozo esté sellado individualmente.
Coloque la tapa de la placa encima del sello de aluminio y guárdelo a menos 80 grados Centígrados. Usando un palo aplicador de madera, raspa suavemente las esporas de la superficie de una colonia de estreptomyces y transfiérala a un tubo de ensayo que contenga un cordón de vidrio estéril y tres mililitros de estreptomyces antibiotic medio. Cierre el tubo de ensayo libremente con una tapa para permitir la aireación.
Usando el mismo palillo aplicador de madera, raya un control de esterilidad en un plato de Petri que contenga el agar de Bennett. Incubar el tubo que contiene el cultivo de semillas a 30 grados Celsius con aireación durante seis días a 250 RPM y la placa de control de esterilidad a 30 grados centígrados durante seis días. Luego, en una superficie nivelada, prepare placas de desreplicación.
Aspirar 23 mililitros de agar caliente de Bennett en una pipeta serológica y dispensar 20 mililitros uniformemente a través de la superficie de una placa rectangular Petri, dejando el resto del medio en la pipeta para evitar la formación de burbujas de aire. Cubra el plato con una tapa. Gire suavemente la placa hasta que el medio cubra todas las áreas de la placa y no la moleste hasta que el agar se haya ajustado completamente.
A continuación, prepare las láminas de membrana de nitrocelulosa utilizando una tapa rectangular de la placa Petri como plantilla de trazado para que las hojas se ajusten a la superficie de la placa de desreplicación. Cortar las sábanas y autoclave en una bolsa estéril. Ahora, revise la placa de control de esterilidad para asegurarse de que no haya contaminantes presentes después de seis días de incubación.
Si no hay contaminación, retire la tapa de la placa rectangular Petri y pipetee 200 microlitros del cultivo de semillas sobre la superficie del agar del Bennett en el plato rectangular. Utilice un hisopo de algodón estéril para esparcir uniformemente el cultivo a través de la superficie de toda la placa. Para colocar la membrana de nitrocelulosa preparada sobre la parte superior del cultivo en la superficie de la placa Petri, alinee el borde inferior de la membrana con el borde inferior de la placa Petri y aplique lentamente la membrana desde el borde inferior hasta el borde superior de la placa.
Utilice un hisopo de algodón estéril para suavizar cualquier burbuja de aire que pueda haberse formado entre la interfaz del agar de membrana, asegurando que la membrana esté al ras del agar. La membrana permite que los organismos esporular en su superficie, mientras que los metabolitos secundarios se pueden excretar en el medio inferior. Vuelva a colocar la tapa en el plato rectangular Petri y colóquela boca abajo en una bolsa de plástico sellada.
Incubar a 30 grados centígrados durante seis días. Después de seis días, retire la placa de desreplicación de la incubadora. Usando pinzas estériles, retire cuidadosamente la membrana de nitrocelulosa de la superficie del agar de Bennett.
Asegúrese de que sólo haya un crecimiento menor de esporas alrededor de los bordes de la placa para disminuir las posibilidades de contaminar la superposición que se agregará. Asegúrese de que la superficie de trabajo esté nivelada y utilice una pipeta serológica para aspirar 23 mililitros de agar MHB ajustado por catión. Cree una superposición dispensando 20 mililitros uniformemente a través de la superficie de la placa de desreplicación, dejando el resto del agar en la pipeta para evitar la formación de burbujas de aire.
Coloque la tapa en la placa. Gire suavemente la placa hasta que el medio cubra todas las áreas y no la moleste hasta que el agar se haya ajustado por completo. Una vez enfriada y solidificada, devuelva la placa de desreplicación a la bolsa de plástico sellada y guárdela boca abajo a cuatro grados centígrados durante la noche, lo que permite la difusión de metabolitos secundarios en la superposición de agar MHB.
El mismo día, inocular una plantilla fresca de ARP o MARP pipeteando primero 100 microlitros de catión ajustados MHB en cada pozo de una placa de 96 pozos. Saque la placa de la biblioteca ARP o MARP congelada del congelador de menos 80 grados Celsius. Retire el sello de aluminio antes de que la condensación comience a formarse en su parte inferior.
Usando herramientas de fijación estériles de 96 pozos, pine cuidadosamente de la placa de biblioteca ARP o MARP de stock congelado e inocular el MHB fresco que contiene placas de 96 pozos. Para minimizar la contaminación durante la desreplicación, prepare tantas placas de biblioteca ARP o MARP necesarias para desreplicar solo dos a tres placas de desreplicación por placa de biblioteca. Una vez completado, coloque un nuevo sello de aluminio estéril en la plantilla congelada y devuélvalo al congelador Celsius de menos 80 grados.
Coloque las placas inoculadas de 96 pozos dentro de una bolsa de plástico sellada libremente e incubar a 37 grados centígrados con agitación a 250 RPM durante 18 horas. Quite la plantilla ARP o MARP de la incubadora y asegúrese de que no haya contaminantes presentes comparando la placa con el mapa de plantillas ARP o MARP. Retire las placas de desreplicación de cuatro grados Centígrados y deje que se equilibren a temperatura ambiente.
Si hay condensación, abra las tapas y deje secar en un ambiente estéril. Usando herramientas de fijación estériles, pin de la placa de la biblioteca ARP o MARP en la superficie de la superposición de agar MHB de las placas de desreplicación. Tenga cuidado de no perforar el agar.
Deje que el inóculo de la plantilla se seque durante tres a cinco minutos. Coloque las placas de desreplicación inoculadas boca abajo en una bolsa de plástico sellada e incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, analice los resultados de la desreplicación comparando el crecimiento en la placa de desreplicación con los pozos que corresponden al mapa ARP o MARP.
En este flujo de trabajo de desreplicación ARP o MARP, se logró un resultado positivo de desreplicación. Donde el extracto preparado para la cepa WAC 8921 fue identificado como un productor de cloramphenicol. La falta de crecimiento de ARP indica la presencia de un antibiótico desconocido o un antibiótico menos comúnmente encontrado que no se consideró en la placa de la biblioteca ARP o MARP.
Se formó un patrón de crecimiento único para el MARP debido a su utilización tanto del tipo salvaje E.coli BW25113 como de un mutante hiper-permeable y con deficiencia de flujo electrónico E.coli BW25113 bamB tolC. Este resultado sugiere la presencia de un compuesto con actividad antimicrobiana que no pudo superar una membrana externa intacta. Estos patrones de crecimiento de E. coli sugieren la esterilización inadecuada de herramientas de fijación, lo que resulta en la transferencia de cepas desconocidas de E.coli a través de la superposición.
Y un ejemplo de la contaminación de placas de la biblioteca de stock congelado ARP o MARP se muestra aquí con tres colonias distintas de E.coli cultivadas en la superficie rectangular de la placa Petri. Este resultado indica que la superposición de agar se perforó durante la desreplicación. La contaminación relacionada con la superposición de MHB también puede ocurrir durante el proceso de desreplicación, mostrando un patrón de crecimiento irregular en la superficie de la superposición.
Lo más importante a recordar al seguir este protocolo es utilizar técnicas asépticas y de esterilización adecuadas para asegurarse de que no se le retendrá en ningún paso debido a la contaminación. Esto incluye la preparación de la membrana de nitrocelulosa para que se ajuste a la superficie de la placa de agar del Bennett lo más cerca posible con el fin de minimizar la propagación de esporas al verter la superposición MHB. Además, también es extremadamente importante utilizar equipos de fijación esterilizados correctamente al inocular las placas de la biblioteca y desreplicar con el fin de producir el resultado más limpio.
Además de desreplicar los antibióticos conocidos, este método se puede aplicar a la identificación de adyuvantes que se pueden utilizar junto con los antibióticos existentes para rescatar su actividad. Aunque la desreplicación de antibióticos no es una técnica nueva, es notoria por ser intensiva en recursos y consumir mucho tiempo. La plataforma ARP y MARP ayudan a arrojar luz sobre cómo la desreplicación de antibióticos no tiene que ser una producción grande, sino que puede completarse durante un período de dos semanas utilizando un equipo mínimo.
