Наш метод отвечает на ключевые вопросы, такие как какова общая нагрузка устойчивых к антибиотикам бактерий в образце воды? Какова идентичность этих бактерий и каковы различные типы устойчивых к антибиотикам признаков и генов, которые они несут? Преимущество нашего протокола заключается в том, что он может обнаруживать даже бактерии, которые не могут быть выращены в лаборатории, которые составляют значительную долю от общего количества бактерий в образце воды.
Следовательно, теоретически ни одна бактерия или ее резистентные черты не остаются без внимания. Этот комбинаторный метод, включающий как основанные на культуре, так и независимые от культуры методы, может быть воспроизведен и настроен для любого образца, полученного из сточных вод, фармацевтических или больничных сточных вод, клинических и неклинических условий и многого другого. Вместе с Девикой экспериментальные процедуры продемонстрируют Харшали Шинде и Майтри Мишра, старшие научные сотрудники моей лаборатории.
Для начала обработайте образец воды асептически, фильтруя его через стерильную муслиновую ткань для удаления любых твердых частиц. Затем последовательно разбавляйте пробу отфильтрованной воды для дальнейшего анализа. Для определения общей бактериальной нагрузки поместите 100 микролитров соответствующих разведений образца отфильтрованной воды на затвердевшие агаровые пластины R2A и дубликаты и равномерно распределите.
Инкубируйте все образцы намазочных пластин при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия в течение 48 часов. После инкубационного периода подсчитывают колонии и экспрессируют общую бактериальную нагрузку в колониеобразующих единицах на миллилитр. Чтобы определить количество устойчивых к антибиотикам бактерий, добавьте антибиотики отдельно в пробирки, содержащие 20 миллилитров стерильного расплавленного Агара R2A, модифицированного примерно при 40 градусах Цельсия.
Закрутите, чтобы перемешать равномерно и вылить на стерильные пластины Петри, прежде чем агар затвердеет. Для контроля качества и проверки эффективности антибиотиков нанесите 100 микролитров бактериальной суспензии на соответствующие антибиотики, содержащие модифицированные пластины агара R2A. Инкубируйте пластины при температуре от 35 до 37 градусов цельсия в течение 48 часов, а затем определите количество бактерий.
Чтобы подготовить шаблон ДНК из изолятов для ПЦР, используя стерильную зубочистку, возьмите одну изолированную чистую колонию изолята, растущего на пластине Петри. Суспендировать бактериальную колонию в 100 микролитрах стерильной двойной дистиллированной воды в микроцентрифужной трубке и кипятить ее в кипящей водяной бане или сухой ванне в течение 10 минут при 100 градусах Цельсия. Центрифугируйте суспензию в 10 000 г в течение двух минут, чтобы гранулировать мусор и перенести супернатант в свежую стерильную микроцентрифужную трубку для использования в качестве шаблона сырой ДНК.
Для амплификации области V3 гена 16S рРНК методом ПЦР готовят 40 микролитров реакционной смеси в трубке ПЦР. Поместите трубку в термоблок и запустите соответствующую программу в термоциклере ПЦР. Для разрешения и визуализации ампликонов ПЦР смешайте 10 микролитров амплифицированного продукта ПЦР в двух микролитрах 6-кратного гелевого нагрузочного буфера и загрузите эту смесь в лунки 1,5%-агарозного геля вместе с 100-базовой парной лестницей ДНК для оценки размера ампликонов.
Проводят электрофорез геля в буфере резервуара TAE при напряжении от 80 до 100 вольт до тех пор, пока следящий краситель не пройдет 3/4 геля. Затем визуализируйте ампликонные полосы под УФ-трансиллюминатором. Чтобы приготовить инокулят, асептически инокулируют одну изолированную очищенную колонию устойчивости к антибиотикам, используя стерильную петлю в двух миллилитрах бульона Лурии-Бертани, или LB, без какого-либо антибиотика, и инкубируют при 37 градусах Цельсия при 80 оборотах в минуту в течение ночи.
На следующий день добавьте от 100 до 150 микролитров выращенной на ночь культуры к двум миллилитрам свежего неселективного бульона LB и инкубируйте в течение двух-четырех часов, пока оптическая плотность при 600 нанометрах не достигнет 0,4-0,5. Разбавить свежевыращенную культуральную суспензию стерильным 0,85% физиологическим раствором и аккуратно перемешать, чтобы равномерно распределить клетки, чтобы достичь плотности культуры, эквивалентной стандарту 0,5 McFarland. В течение 15 минут после разведения окуните стерильный ватный тампон в инокулятив и удалите лишнюю суспензию, чтобы избежать чрезмерной прививки пластин.
Затем равномерно распределите культуру по подготовленной агаровой пластине Мюллера Хинтона, начиная сверху и переходя взад и вперед от края к краю. Затем поверните пластину на 60 градусов и снова начинайте мазки. Чтобы поместить диски антибиотика, используйте пламенно стерилизованные щипцы и асептически перенесите диски антибиотиков на инокулированные агаровые пластины.
Осторожно надавите на диски, чтобы обеспечить полный уровень контакта с агаром. Поместите соответствующее количество антибиотических дисков на агаровую пластину, рассмотрев организм, используемый антибиотик и размер пластины, чтобы избежать перекрытия зон ингибирования. В течение 15 минут после применения антибиотика в диске инвертируйте пластины и инкубируйте их при 37 градусах Цельсия в течение ночи.
На следующий день измерьте диаметр зоны ингибирования в миллиметрах и интерпретируйте ее в соответствии со значениями точек останова, заданными EUCAST. Было обнаружено, что общая бактериальная нагрузка в образце воды составляет от 3,0 х 10 до девятого КОЕ/мл, а устойчивая к антибиотикам бактериальная нагрузка была высокой. Секвенированные культурные изоляты устойчивости к антибиотикам принадлежали к семейству Enterobacteriaceae, большинство из которых были Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae.
Кроме того, были выявлены редкие условно-патогенные бактерии. Тестирование чувствительности к антибиотикам методом диффузии диска показало индекс множественной устойчивости к антибиотикам примерно 0,2 для восьми изолятов, что указывает на высокую степень резистентности. Однако виды Comamonas и Arthrobacter не показали устойчивости ни к одному из протестированных антибиотиков.
Культивируемые изоляты выявили наличие генов устойчивости к антибиотикам, кодирующих факторы против бета-лактамов, триметопримов и аминогликозидов. Метагеномный анализ ДНК для общего бактериального разнообразия привел к идентификации 50 типов, что указывает на высокое бактериальное разнообразие, где протеобактерии были наиболее доминирующим типом, состоящим из классов альфапротеобактерий, бетапротеобактерий и гаммапротеобактерий. На уровне отряда наиболее распространенным был Burkholderiales, относящийся к классу бетапротеобактерий.
На общем уровне Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium и Comamonas были одними из распространенных бактерий. Метагеномный анализ ДНК также выявил больше генов устойчивости к антибиотикам. В этом методе стадия последовательного разведения имеет решающее значение, так как любая ошибка может привести к неправильной интерпретации общего КОЕ и антибиотикорезистентной бактериальной нагрузки.
Кроме того, диаметр зоны ингибирования следует тщательно измерить, чтобы правильно интерпретировать, является ли изолят устойчивым или чувствительным. Используя эти протоколы, помимо образца воды, можно изучить любой другой образец, будь то экологический, пищевой или клинический. Более того, помимо бактерий, другие микробные популяции в любой экосистеме также могут быть изучены с использованием аналогичных подходов.
