Unsere Methode beantwortet zentrale Fragen, wie zum Beispiel: Wie hoch ist die Gesamtbelastung mit antibiotikaresistenten Bakterien in der Wasserprobe? Was ist die Identität dieser Bakterien und was sind verschiedene Arten von antibiotikaresistenten Merkmalen und Genen, die sie tragen? Der Vorteil unseres Protokolls besteht darin, dass es auch Bakterien nachweisen kann, die nicht im Labor gezüchtet werden können und einen erheblichen Anteil der gesamten Bakterien in der Wasserprobe ausmachen.
Daher wird theoretisch kein Bakterium oder seine resistenten Eigenschaften ausgelassen. Diese kombinatorische Technik, die sowohl kulturbasierte als auch kulturunabhängige Techniken umfasst, kann für jede Probe repliziert und angepasst werden, die aus Abwasser, pharmazeutischen oder Krankenhausabwässern, klinischen und nichtklinischen Umgebungen und mehr gewonnen wird. Neben Devika werden Harshali Shinde und Maitri Mishra, beide leitende Forschungsstipendiaten aus meinem Labor, die experimentellen Verfahren demonstrieren.
Verarbeiten Sie die Wasserprobe zunächst aseptisch, indem Sie sie durch ein steriles Musselintuch filtrieren, um Partikel zu entfernen. Anschließend wird die gefilterte Wasserprobe zur weiteren Analyse seriell verdünnt. Um die Gesamtkeimbelastung zu bestimmen, werden 100 Mikroliter der entsprechenden Verdünnungen der gefilterten Wasserprobe auf die erstarrten R2A-Agarplatten und Duplikate gegeben und gleichmäßig verteilt.
Inkubieren Sie alle Probenstreuplatten bei 35 bis 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Nach der Inkubationszeit werden die Kolonien gezählt und die Gesamtkeimbelastung in koloniebildenden Einheiten pro Milliliter ausgedrückt. Um die Anzahl der antibiotikaresistenten Keime zu bestimmen, geben Sie die Antibiotika separat in Röhrchen mit 20 Millilitern sterilem geschmolzenem R2A-Agar, das etwa bei 40 Grad Celsius modifiziert wurde.
Schwenken, um sich gleichmäßig zu vermischen und auf sterile Petriplatten zu gießen, bevor der Agar erstarrt. Zur Qualitätskontrolle und zur Überprüfung der Wirksamkeit von Antibiotika verteilen Sie 100 Mikroliter Bakteriensuspension auf ihre jeweiligen antibiotischen, mit R2A-Agar modifizierten Platten. Inkubieren Sie die Platten bei 35 bis 37 Grad Celsius für 48 Stunden und bestimmen Sie dann die Keimzahl.
Um die DNA-Vorlage aus den Isolaten für die PCR mit einem sterilen Zahnstocher vorzubereiten, nehmen Sie eine einzelne isolierte reine Kolonie des Isolats, die auf einer Petriplatte wächst. Suspendieren Sie die Bakterienkolonie in 100 Mikroliter sterilem doppelt destilliertem Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen und kochen Sie sie in einem kochenden Wasserbad oder einem Trockenbad für 10 Minuten bei 100 Grad Celsius. Die Suspension wird bei 10.000 g zwei Minuten lang zentrifugiert, um die Trümmer zu pelletieren und den Überstand in ein frisches steriles Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen, das als rohe DNA-Vorlage verwendet wird.
Um die V3-Region des 16S-rRNA-Gens mittels PCR zu amplifizieren, werden 40 Mikroliter des Reaktionsgemisches in einem PCR-Röhrchen hergestellt. Legen Sie das Röhrchen in den Thermoblock und führen Sie das entsprechende Programm im PCR-Thermocycler aus. Um die PCR-Amplikons aufzulösen und zu visualisieren, mischen Sie 10 Mikroliter des amplifizierten PCR-Produkts in zwei Mikroliter 6x Gel-Ladungspuffer und laden Sie diese Mischung in die Vertiefungen eines 1,5%igen Agarose-Gels zusammen mit einer 100-Basenpaar-DNA-Leiter zur Schätzung der Größe der Amplikonen.
Das Gel wird im TAE-Tankpuffer bei 80 bis 100 Volt elektrophorisiert, bis der Tracking-Farbstoff 3/4 des Gels laufen lässt. Visualisieren Sie dann die Amplikonbänder unter einem UV-Transilluminator. Zur Vorbereitung des Inokulums wird eine einzelne isolierte gereinigte Antibiotikaresistenzkolonie unter Verwendung einer sterilen Schleife in zwei Millilitern Luria-Bertani- oder LB-Brühe ohne Antibiotikum aseptisch geimpft und über Nacht bei 37 Grad Celsius bei 80 U/min inkubiert.
Am nächsten Tag fügen Sie 100 bis 150 Mikroliter der über Nacht gewachsenen Kultur zu zwei Millilitern frischer, nicht selektiver LB-Bouillon hinzu und inkubieren Sie für zwei bis vier Stunden, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,4 bis 0,5 erreicht. Verdünnen Sie die frisch gezüchtete Kultursuspension mit steriler 0,85%iger Kochsalzlösung und mischen Sie vorsichtig, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, um eine Kulturdichte zu erreichen, die dem McFarland-Standard von 0,5 entspricht. Tauchen Sie innerhalb von 15 Minuten nach der Verdünnung ein steriles Wattestäbchen in das Inokulum und entfernen Sie die überschüssige Suspension, um eine Überimpfung der Platten zu vermeiden.
Verteilen Sie dann die Kultur gleichmäßig auf der vorbereiteten Mueller-Hinton-Agarplatte, beginnend von oben und von Rand zu Rand hin und her. Drehen Sie dann die Platte um 60 Grad und beginnen Sie erneut mit dem Abwischen. Um die antibiotischen Scheiben zu platzieren, verwenden Sie eine flammsterilisierte Pinzette und übertragen Sie die antibiotischen Scheiben aseptisch auf die beimpften Agarplatten.
Drücken Sie die Scheiben vorsichtig an, um einen vollständigen Kontakt mit dem Agar zu gewährleisten. Legen Sie die entsprechende Anzahl von Antibiotikascheiben auf die Agarplatte unter Berücksichtigung des Organismus, des verwendeten Antibiotikums und der Plattengröße, um eine Überlappung der Hemmzonen zu vermeiden. Innerhalb von 15 Minuten nach der Antibiotika-Bandscheibenapplikation die Platten umdrehen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Messen Sie am nächsten Tag den Inhibitionsdurchmesser in Millimetern und interpretieren Sie ihn gemäß den von EUCAST angegebenen Haltepunktwerten. Es wurde festgestellt, dass die Gesamtbakterienbelastung in der Wasserprobe 3,0 x 10 bis zur neunten KBE/ml betrug, und die antibiotikaresistente Bakterienbelastung war hoch. Die sequenzierten Antibiotikaresistenz-Kulturisolate gehörten zur Familie der Enterobacteriaceae, wobei die meisten Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae waren.
Darüber hinaus wurden auch seltene opportunistische Bakterien identifiziert. Der Antibiotika-Empfindlichkeitstest mittels Bandscheibendiffusionsmethode ergab einen Multiplen Antibiotikaresistenzindex von etwa 0,2 für acht Isolate, was auf einen hohen Grad an Resistenz hinweist. Comamonas- und Arthrobacter-Arten zeigten jedoch keine Resistenz gegen eines der getesteten Antibiotika.
Die kultivierbaren Isolate zeigten das Vorhandensein von Antibiotikaresistenzgenen, die für die Faktoren gegen Beta-Lactame, Trimethoprim und Aminoglykoside kodieren. Die metagenomische DNA-Analyse der gesamten bakteriellen Diversität führte zur Identifizierung von 50 Stämmen, was auf die hohe bakterielle Diversität hinweist, bei der Proteobakterien der dominanteste Stamm war, bestehend aus den Klassen Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria und Gammaproteobacteria. Auf der Ordnungsebene war Burkholderiales am weitesten verbreitet und gehörte zur Klasse der Betaproteobakterien.
Auf der allgemeinen Ebene waren Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium und Comamonas einige der reichlich vorhandenen Bakterien. Die metagenomische DNA-Analyse ergab auch mehr Antibiotikaresistenzgene. Bei dieser Methode ist der serielle Verdünnungsschritt entscheidend, da jeder Fehler zu einer falschen Interpretation der Gesamt-KBE und der antibiotikaresistenten Bakterienbelastung führen kann.
Außerdem sollte der Durchmesser der Hemmzone sorgfältig gemessen werden, um richtig zu interpretieren, ob das Isolat resistent oder empfindlich ist. Mit diesen Protokollen kann neben der Wasserprobe auch jede andere Probe, sei es aus Umwelt-, Lebensmittel- oder klinischer Probe, untersucht werden. Darüber hinaus können neben Bakterien auch andere mikrobielle Populationen in jedem Ökosystem mit ähnlichen Ansätzen untersucht werden.
