Yöntemimiz, su örneğindeki antibiyotiğe dirençli bakterilerin toplam yükü nedir? Bu bakterilerin kimliği nedir ve taşıdıkları farklı antibiyotik dirençli özellikler ve genler nelerdir? Protokolümüzün avantajı, su numunesindeki toplam bakterilerin önemli bir bölümünü oluşturan laboratuvarda yetiştirilemeyen bakterileri bile tespit edebilmesidir.
Bu nedenle, teorik olarak, hiçbir bakteri veya dirençli özellikleri dışarıda bırakılmaz. Hem kültür temelli hem de kültürden bağımsız teknikleri içeren bu kombinatoryal teknik, kanalizasyon, farmasötik veya hastane atıkları, klinik ve klinik olmayan ortamlar ve daha fazlasından elde edilen herhangi bir numune için çoğaltılabilir ve özelleştirilebilir. Devika ile birlikte, deneysel prosedürleri gösteren, her ikisi de laboratuvarımdan kıdemli araştırma görevlisi olan Harshali Shinde ve Maitri Mishra olacak.
Başlamak için, herhangi bir partikül maddeyi çıkarmak için su numunesini steril bir müslin bezden filtreleyerek aseptik olarak işleyin. Ardından, daha fazla analiz için filtrelenmiş su numunesini seri olarak seyreltin. Toplam bakteri yükünü belirlemek için, filtrelenmiş su numunesinin uygun seyreltilerinden 100 mikrolitresini katılaşmış R2A agar plakalarına ve kopyalarına yerleştirin ve eşit şekilde yayın.
Tüm numune yayılma plakalarını 48 saat boyunca 35 ila 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka döneminden sonra, kolonileri sayın ve mililitre başına koloni oluşturan birimlerdeki toplam bakteri yükünü ifade edin. Antibiyotiğe dirençli bakteri sayısını belirlemek için, antibiyotikleri yaklaşık 40 santigrat derecede modifiye edilmiş 20 mililitre steril erimiş R2A agar içeren tüplere ayrı ayrı ekleyin.
Eşit şekilde karıştırmak için girdap yapın ve agar katılaşmadan önce steril Petri plakalarına dökün. Kalite kontrolü ve antibiyotiklerin etkinliğini kontrol etmek için, R2A agar modifiye plakaları içeren ilgili antibiyotiklerine 100 mikrolitre bakteriyel süspansiyon yayın. Plakaları 48 saat boyunca 35 ila 37 santigrat derecede inkübe edin ve ardından bakteri sayısını belirleyin.
DNA şablonunu PCR için izolatlardan hazırlamak için, steril bir kürdan kullanarak, bir Petri plakasında büyüyen izolatın tek bir izole saf kolonisini alın. Bakteri kolonisini bir mikro santrifüj tüpünde 100 mikrolitre steril çift damıtılmış suda askıya alın ve kaynar su banyosunda veya kuru banyoda 100 santigrat derecede 10 dakika kaynatın. Enkazı peletlemek için süspansiyonu iki dakika boyunca 10.000 g'da santrifüj yapın ve süpernatantı ham DNA şablonu olarak kullanmak üzere taze steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
16S rRNA geninin V3 bölgesini PCR ile yükseltmek için, bir PCR tüpünde reaksiyon karışımının 40 mikrolitresini hazırlayın. Tüpü termal bloğa yerleştirin ve PCR termal çevrimcisinde uygun programı çalıştırın. PCR amplikonlarını çözmek ve görselleştirmek için, amplifiye PCR ürününün 10 mikrolitresini iki mikrolitre 6x jel yükleme tamponunda karıştırın ve bu karışımı, amplikonların boyutunu tahmin etmek için 100 baz eşleştirilmiş DNA merdiveni ile birlikte% 1.5'lik bir agaroz jelinin kuyucuklarına yükleyin.
İzleme boyası jelin 3 / 4'ünü çalıştırana kadar TAE tank tamponundaki jelin elektroforezini 80 ila 100 voltta gerçekleştirin. Ardından amplikon bantlarını bir UV transilluminatörün altında görselleştirin. İnokulu hazırlamak için, iki mililitre Luria-Bertani veya LB, herhangi bir antibiyotik içermeyen et suyunda steril bir döngü kullanarak tek bir izole saflaştırılmış antibiyotik direnci kolonisini aseptik olarak aşılayın ve gece boyunca 80 rpm'de 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, iki mililitre taze seçici olmayan LB suyuna gece boyunca yetiştirilen kültürün 100 ila 150 mikrolitresini ekleyin ve 600 nanometredeki optik yoğunluk 0.4 ila 0.5'e ulaşana kadar iki ila dört saat kuluçkaya yatırın. Taze yetiştirilmiş kültür süspansiyonunu steril% 0.85 tuzlu su çözeltisi kullanarak seyreltin ve 0.5 McFarland standardına eşdeğer bir kültür yoğunluğuna ulaşmak için hücreleri eşit olarak dağıtmak için hafifçe karıştırın. Seyreltmeden sonraki 15 dakika içinde, steril bir pamuklu çubuğu inokuluma batırın ve plakaların aşırı aşılanmasını önlemek için fazla süspansiyonu çıkarın.
Daha sonra kültürü hazırlanan Mueller Hinton agar plakasına eşit olarak yayın, yukarıdan başlayarak ve kenardan kenara ileri geri giderek. Ardından plakayı 60 derece döndürün ve tekrar ovalamaya başlayın. Antibiyotik diskleri yerleştirmek için, alevle sterilize edilmiş forseps kullanın ve antibiyotik disklerini aseptik olarak aşılanmış agar plakalarına aktarın.
Agar ile tam temas seviyesini sağlamak için diskleri hafifçe bastırın. İnhibisyon bölgelerinin üst üste binmesini önlemek için organizmanın kullanılan antibiyotiği ve plaka boyutunu göz önünde bulundurarak agar plakasına uygun sayıda antibiyotik disk yerleştirin. Antibiyotik disk uygulamasından sonraki 15 dakika içinde, plakaları ters çevirin ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, inhibisyon çapı bölgesini milimetre cinsinden ölçün ve EUCAST tarafından verilen kesme noktası değerlerine göre yorumlayın. Su numunesindeki toplam bakteri yükünün dokuzuncu CFU / mL'ye 3.0 x 10 olduğu ve antibiyotiğe dirençli bakteri yükünün yüksek olduğu bulunmuştur. Sıralanan antibiyotik direnci kültürel izolatları, çoğu Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae olan Enterobacteriaceae ailesine aitti.
Ek olarak, nadir fırsatçı bakteriler de tanımlanmıştır. Disk difüzyon yöntemiyle antibiyotik duyarlılık testi, sekiz izolat için yaklaşık 0.2'lik bir Çoklu Antibiyotik Direnci indeksi gösterdi ve bu da yüksek derecede direnç gösterdi. Bununla birlikte, Comamonas ve Arthrobacter türleri test edilen antibiyotiklerin hiçbirine direnç göstermedi.
Kültürlenebilir izolatlar, beta-laktamlara, trimetoprimlere ve aminoglikozitlere karşı faktörleri kodlayan antibiyotik direnç genlerinin varlığını ortaya koydu. Toplam bakteri çeşitliliği için metagenomik DNA analizi, Proteobakterilerin Alfaproteobakteriler, Betaproteobakteriler ve Gamaproteobakteri sınıflarından oluşan en baskın filum olduğu yüksek bakteri çeşitliliğini gösteren 50 filumun tanımlanmasına yol açmıştır. Sipariş düzeyinde, Burkholderiales, Betaproteobacteria sınıfına ait en yaygın olanıydı.
Genel düzeyde, Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium ve Comamonas bol miktarda bulunan bakterilerden bazılarıydı. Metagenomik DNA analizi ayrıca daha fazla antibiyotik direnç geni ortaya çıkardı. Bu yöntemde, seri seyreltme adımı kritiktir, çünkü herhangi bir hata toplam CFU'nun ve antibiyotiğe dirençli bakteri yükünün yanlış yorumlanmasına neden olabilir.
Ayrıca, inhibisyon bölgesinin çapı, izolatın dirençli veya hassas olup olmadığını doğru bir şekilde yorumlamak için dikkatlice ölçülmelidir. Bu protokolleri kullanarak, su örneğinin yanı sıra, çevresel, gıda veya klinik olsun, başka herhangi bir örnek incelenebilir. Dahası, bakterilerin yanı sıra, herhangi bir ekosistemdeki diğer mikrobiyal popülasyonlar da benzer yaklaşımlar kullanılarak incelenebilir.
