Este protocolo permitirá al investigador diseccionar la arteria de interés y aislar las células vasculares para realizar una amplia gama de pruebas funcionales. El investigador puede investigar diferentes lechos vasculares y tipo de células para ampliar el conocimiento de la biología celular vascular y el mecanismo de la disfunción vascular. Este método es más aplicable a los investigadores que investigan la biología celular vascular básica, así como la disfunción celular vascular en modelos animales de enfermedad.
Se debe tener especial cuidado para optimizar el protocolo de digestión, especialmente cuando los lechos vasculares de interés difieren de los presentados aquí. Para comenzar, asegure el mouse con pasadores de disección y rocíe la superficie ventral con etanol al 70%. Use fórceps para levantar la piel justo por encima de los genitales y haga una pequeña incisión de aproximadamente dos milímetros en la piel.
Inserte la punta de las tijeras en el sitio de la incisión y haga una incisión de cuatro a cinco centímetros de largo en la línea media comenzando en la incisión inicial y diseccionando cranealmente hasta la base del esternón. Haga una incisión de un centímetro que se extienda lateralmente desde la línea media inmediatamente debajo de la extremidad anterior. Haga una incisión diagonal de un centímetro entre la extremidad posterior y los genitales.
Haga pequeños cortes a lo largo de las incisiones cutáneas de la línea media para despegar el tejido conectivo asociado y exponga el depósito adiposo subcutáneo. Identificar el tejido adiposo subcutáneo en forma de C y la arteria o vena que corre perpendicular a la cavidad abdominal. Comience desde la parte inferior de la forma de C cerca de los genitales y agarre suavemente el tejido adiposo para exponer los tejidos conectivos.
Haga pequeños cortes en el tejido conectivo para separar la grasa de la piel y evite alterar la vasculatura expuesta. Continúe diseccionando el tejido conectivo hasta que el tejido adiposo subcutáneo pueda eliminarse intacto. Separe cuidadosamente la arteria expuesta del tejido conectivo circundante.
Almacene el tejido adiposo subcutáneo aislado en tampón HEPES sobre hielo. Repita la disección para el depósito adiposo subcutáneo posterior restante. Para aislar el depósito adiposo mesentérico, use pinzas Graefe para levantar la delgada pared de la cavidad peritoneal por encima de la vejiga urinaria y haga una pequeña incisión con tijeras rectas.
Levante lentamente la pared de la cavidad peritoneal e inserte las tijeras rectas del iris en el sitio de la incisión. Haga una incisión de cuatro a cinco centímetros desde la vejiga urinaria hasta el esternón. Luego haga dos incisiones horizontales de un centímetro con las tijeras de iris rectas que se extienden lateralmente desde la línea media hasta inmediatamente por encima de la extremidad posterior y por debajo de la extremidad anterior.
Use los fórceps de Graefe para despegar la musculatura abdominal y exponer las vísceras peritoneales. Use un par de pinzas número cinco para levantar los intestinos fuera de la cavidad visceral para revelar el tejido adiposo mesentérico. Use las tijeras curvas y las pinzas número cinco para separar el tejido adiposo a lo largo del colon, comenzando desde el ciego hasta donde el colon desciende de la vista.
Luego, separe el tejido adiposo a lo largo del intestino delgado hasta el páncreas. Extirpar una pequeña parte del páncreas para aislar completamente el tejido adiposo mesentérico. Almacene el adiposo mesentérico aislado en el tampón HEPES en hielo.
Para aislar las arterias, primero transfiera el tejido adiposo a un plato de disección que contenga 10 mililitros de tampón HEPES frío. Bajo un microscopio estereoscópico, coloque el tejido adiposo subcutáneo para exponer el par de venas arteriales. Coloque el tejido adiposo visceral para exponer la forma de coliflor y el par de venas arteriales respectivas.
Use fórceps número 55 para eliminar cuidadosamente el parénquimatoso adiposo de la arteria. Retire pequeños trozos de tejido adiposo a la vez sin dañar la vasculatura de interés. Continúe hasta que las arterias estén completamente vacías de tejido adiposo parenquimatoso.
Use pinzas número cinco para transferir las arterias limpias a un nuevo tubo con tampón HEPES fresco y manténgalas en hielo hasta que esté listo para la digestión. Primero, agregue un miligramo de dispasa y elastasa a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Agregue dos mililitros de solución de disociación, vórtice e incube a 37 grados centígrados hasta que se disuelva por completo.
Use pinzas número cinco para transferir las arterias limpias a los tubos de muestra respectivos. Incubar los tubos a 37 grados centígrados durante una hora con una agitación suave por inversión cada 10 a 15 minutos. Mientras tanto, agregue un miligramo de colagenasa tipo uno por muestra a los tubos nuevos.
Después de la incubación, permita que las arterias se asienten en la parte inferior del tubo y transfiera 500 microlitros del tampón desde la parte superior a los tubos que contienen colagenasa. Vortex y devolver esta solución a los tubos de muestra respectivos. Incubar las muestras a 37 grados centígrados durante 15 minutos.
Asegúrese de que las arterias se separen en pedazos al agitar el tubo de muestra. Usando una pipeta de vidrio, triture vigorosamente el tejido digerido de 10 a 15 veces para disociar mecánicamente las células. Pasar las muestras digeridas a través de un filtro de células de 70 micras o un filtro de tubo de citometría de flujo para obtener suspensiones de células individuales.
Centrifugar la suspensión de una sola célula y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de PBS con 5% BSA durante 30 minutos. Añadir un microlitro de tinción de viabilidad celular e incubar en la oscuridad durante 30 minutos.
Centrifugar la suspensión celular y volver a suspender el pellet celular en 200 microlitros de PBS con 1% BSA. Agregue anticuerpos primarios conjugados a CD31 y CD45 e incube en un balancín en el refrigerador durante 15 minutos. Lave las células agregando un mililitro de PBS con 1% BSA directamente a la suspensión celular.
Centrifugar la suspensión celular y volver a suspender el pellet en 200 microlitros de formaldehído al 1% con BSA al 0,1%. Cubra los tubos con papel de aluminio y guárdelos en el refrigerador hasta que estén listos para la citometría de flujo. Las preparaciones celulares obtenidas de arterias adiposas subcutáneas digeridas se utilizaron para identificar las poblaciones de células endoteliales mediante citometría de flujo.
Las células CD45 negativas CD31 positivas se identificaron como células endoteliales. La tinción de viabilidad celular permitió la identificación de solo aquellas células viables que sobrevivieron al protocolo de aislamiento y digestión antes de la fijación. Para identificar las diferencias en la expresión de proteínas de membrana y células endoteliales de vasculatura de depósito adiposo distintas, las células aisladas fueron sondeadas para detectar la translocasa de ácidos grasos CD36.
Se identificaron células endoteliales CD36 positivas en tejido adiposo subcutáneo y mesentérico. La cuantificación de la expresión de CD36 y las células endoteliales subcutáneas y mesentéricas reveló que tanto el porcentaje de células endoteliales que expresan CD36 como la intensidad de la expresión de CD36 fueron mayores en las células endoteliales subcutáneas. Es crucial diseccionar, identificar y limpiar cuidadosamente las arterias.
Lo más importante es que el protocolo de digestión debe producir un rendimiento suficiente de células viables para aplicaciones posteriores. Después de este procedimiento, la población celular aislada se puede utilizar para aplicaciones que incluyen, entre otras, electrofisiología, perfiles moleculares y generación de línea celular primaria para la detección de fármacos in vitro.
