이 프로토콜을 통해 연구원은 관심있는 동맥을 해부하고 혈관 세포를 분리하여 광범위한 기능 테스트를 수행 할 수 있습니다. 연구원은 다양한 혈관 층과 세포 유형을 조사하여 혈관 세포 생물학 및 혈관 기능 장애 메커니즘에 대한 지식을 확장할 수 있습니다. 이 방법은 질병의 동물 모델에서 혈관 세포 기능 장애뿐만 아니라 기본적인 혈관 세포 생물학을 조사하는 연구자에게 가장 적합합니다.
소화 프로토콜을 최적화하기 위해 특별한주의를 기울여야하며, 특히 관심있는 혈관 층이 여기에 제시된 것과 다른 경우에는 더욱 그렇습니다. 시작하려면 해부 핀을 사용하여 마우스를 고정하고 복부 표면에 70 % 에탄올을 뿌립니다. 집게를 사용하여 생식기 바로 위의 피부를 들어 올리고 피부에 약 2mm의 작은 절개를하십시오.
가위 끝을 절개 부위에 삽입하고 초기 절개에서 시작하여 흉골 기저부까지 두개골로 해부하는 4-5cm 길이의 정중선 절개를합니다. 앞다리 바로 아래의 정중선에서 옆으로 1cm 연장되는 절개를하십시오. 뒷다리와 생식기 사이에 대각선 1cm 절개를하십시오.
정중선 피부 절개를 따라 작은 절개를 하여 관련 결합 조직을 벗겨내고 피하 지방 저장소를 노출시킵니다. C 자형 피하 지방 조직과 복강에 수직으로 움직이는 동맥 또는 정맥을 확인하십시오. 생식기 근처의 C 자 모양의 바닥에서 시작하여 지방 조직을 부드럽게 잡고 결합 조직을 노출시킵니다.
결합 조직을 약간 잘라 피부에서 지방을 분리하고 노출 된 혈관계를 방해하지 않도록하십시오. 피하 지방 조직이 손상되지 않게 제거 될 때까지 결합 조직을 계속 해부하십시오. 노출 된 동맥을 주변 결합 조직과 조심스럽게 분리하십시오.
분리 된 피하 지방을 얼음 위의 hepes 버퍼에 저장하십시오. 나머지 후방 피하 지방 저장소에 대해 해부를 반복하십시오. 장간막 지방 저장소를 분리하려면 Graefe Forceps를 사용하여 방광 위의 얇은 복강 벽을 들어 올리고 직선 가위로 작은 절개를하십시오.
복강 벽을 천천히 들어 올리고 직선 홍채 가위를 절개 부위에 삽입합니다. 방광에서 흉골까지 4-5 센티미터의 절개를하십시오. 그런 다음 정중선에서 뒷다리 바로 위와 앞다리 아래까지 측면으로 확장되는 직선 홍채 가위로 1cm의 수평 절개 두 개를 만듭니다.
Graefe 집게를 사용하여 복부 근육계를 벗겨내고 복막 내장을 노출시킵니다. 한 쌍의 5 번 집게를 사용하여 내장강에서 내장을 들어 올려 장간막 지방을 드러냅니다. 구부러진 가위와 5 번 집게를 사용하여 맹장에서 시작하여 결장이 보이는 곳까지 결장을 따라 지방을 분리하십시오.
그런 다음 소장을 따라 지방을 췌장으로 분리하십시오. 장간막 지방을 완전히 분리하기 위해 췌장의 작은 부분을 제거하십시오. 분리 된 장간막 지방을 얼음 위의 hepes 버퍼에 저장하십시오.
동맥을 분리하려면 먼저 지방 조직을 10 밀리리터의 차가운 hepes 완충액이 들어있는 해부 접시로 옮깁니다. 실체 현미경으로 피하 지방 조직을 위치시켜 동맥 정맥 쌍을 노출시킵니다. 내장 지방 조직을 배치하여 콜리플라워 모양과 각각의 동맥 정맥 쌍을 노출시킵니다.
55 번 집게를 사용하여 동맥에서 실질 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 관심있는 혈관 구조를 손상시키지 않고 한 번에 작은 지방 조각을 제거하십시오. 동맥에 실질 조직 조직이 완전히 없어 질 때까지 계속하십시오.
5 번 집게를 사용하여 깨끗한 동맥을 신선한 hepes 버퍼가있는 새 튜브로 옮기고 소화 준비가 될 때까지 얼음 위에 두십시오. 먼저, 2 밀리리터의 마이크로 원심 분리기 튜브에 각각 1 밀리그램의 디스 파제 및 엘라 스타제를 첨가하십시오. 2 밀리리터의 해리 용액 인 와류를 넣고 완전히 용해 될 때까지 섭씨 37도에서 배양합니다.
5번 집게를 사용하여 세척된 동맥을 각 샘플 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하고 10-15 분마다 반전시켜 부드럽게 교반합니다. 그 동안 샘플 당 1 밀리그램의 콜라게나제 유형을 새 튜브에 추가하십시오.
배양 후 동맥이 튜브 바닥에 정착하고 상단에서 콜라게나 제가 들어있는 튜브로 500 마이크로 리터의 완충액을 옮깁니다. 와류를 일으키고 이 용액을 각 샘플 튜브에 반환합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.
샘플 튜브를 흔들 때 동맥이 조각으로 분리되는지 확인하십시오. 유리 피펫을 사용하여 소화 된 조직을 10-15 회 격렬하게 분쇄하여 세포를 기계적으로 해리시킵니다. 소화된 샘플을 70 미크론 세포 스트레이너 또는 유세포분석 튜브 스트레이너를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
단일 세포 현탁액을 원심분리하고 상청액을 제거한다. 세포 펠릿을 PBS 1밀리리터에 5%BSA로 30분 동안 재현탁합니다. 1 마이크로 리터의 세포 생존율 염색을 추가하고 30 분 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
세포 현탁액을 원심분리하고 1%BSA로 200마이크로리터의 PBS에 세포 펠릿을 다시 현탁합니다. CD31 및 CD45에 접합된 1차 항체를 추가하고 냉장고의 로커에서 15분 동안 배양합니다. 1%BSA가 포함된 PBS 1밀리리터를 세포 현탁액에 직접 첨가하여 세포를 세척합니다.
세포 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 0.1% BSA로 200마이크로리터의 1% 포름알데히드에 다시 현탁합니다. 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 유세포 분석 준비가 될 때까지 냉장고에 보관하십시오. 소화된 피하 지방 동맥으로부터 수득된 세포 제제를 유동 세포분석을 사용하여 내피 세포 집단을 확인하기 위해 사용하였다.
CD31 양성 CD45 음성 세포는 내피 세포로서 확인되었다. 세포 생존율 염색은 고정 전에 분리 및 소화 프로토콜에서 살아남은 생존 가능한 세포만을 식별할 수 있게 했습니다. 별개의 지방 데포 혈관구조로부터 막 단백질 발현 및 내피 세포의 차이를 확인하기 위해, 분리된 세포를 지방산 트랜스로카제 CD36에 대해 프로빙하였다.
CD36 양성 내피 세포는 피하 및 장간막 지방에서 확인되었습니다. CD36 발현 및 피하 및 장간막 내피 세포의 정량화는 CD36을 발현하는 내피 세포의 백분율 및 CD36 발현의 강도 모두 피하 내피 세포에서 더 큰 것으로 나타났다. 동맥을 조심스럽게 해부, 식별 및 청소하는 것이 중요합니다.
가장 중요한 것은 분해 프로토콜이 다운스트림 적용을 위한 충분한 수율의 생존 세포를 생성해야 한다는 것입니다. 이 절차에 따라 분리된 세포 집단은 전기 생리학, 분자 프로파일링 및 시험관 내 약물 스크리닝을 위한 1차 세포주 생성을 포함하되 이에 국한되지 않는 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
