Этот протокол позволит исследователю препарировать интересующую артерию и изолировать сосудистые клетки для выполнения широкого спектра функциональных тестов. Исследователь может исследовать различные сосудистые русла и тип клеток, чтобы расширить знания о биологии сосудистых клеток и механизме сосудистой дисфункции. Этот метод наиболее применим к исследователям, изучающим базовую биологию сосудистых клеток, а также дисфункцию сосудистых клеток на животных моделях заболевания.
Следует проявлять особую осторожность для оптимизации протокола пищеварения, особенно там, где сосудистые русла, представляющие интерес, отличаются от представленных здесь. Для начала закрепите мышь с помощью рассеченных штифтов и распылите на вентральную поверхность 70% этанола. Используйте щипцы, чтобы поднять кожу прямо над гениталиями, и сделайте небольшой разрез примерно на два миллиметра в коже.
Вставьте кончик ножниц в место разреза и сделайте разрез средней линии длиной от четырех до пяти сантиметров, начиная с начального разреза и рассекая краниально до основания грудины. Сделайте разрез на один сантиметр, простирающийся сбоку от средней линии непосредственно ниже передней конечности. Сделайте диагональный сантиметровый разрез между задней конечностью и половыми органами.
Сделайте небольшие разрезы вдоль средней линии разрезов кожи, чтобы отклеить связанную соединительную ткань и обнажить подкожное жировое депо. Определите С-образную подкожную жировую клетчатку и артерию или вену, которая проходит перпендикулярно брюшной полости. Начните с нижней части С-образной формы возле гениталий и осторожно захватите жировую ткань, чтобы обнажить соединительные ткани.
Сделайте небольшие разрезы в соединительной ткани, чтобы отделить жир от кожи, и не нарушите открытую сосудистую систему. Продолжайте рассечение соединительной ткани до тех пор, пока подкожная жировая клетчатка не будет удалена неповрежденной. Тщательно отделите открытую артерию от окружающей соединительной ткани.
Хранить изолированный подкожный жировой слой в буфере HEPES на льду. Повторите рассечение для оставшегося заднего подкожного жирового депо. Чтобы изолировать брыжеечное жировое депо, используйте щипцы Graefe, чтобы поднять тонкую стенку брюшной полости над мочевым пузырем и сделать небольшой разрез с помощью прямых ножниц.
Медленно поднимите стенку брюшной полости и вставьте прямые ножницы радужной оболочки в место разреза. Сделайте разрез на четыре-пять сантиметров от мочевого пузыря до грудины. Затем сделайте два горизонтальных разреза в один сантиметр с прямыми ножницами радужной оболочки, простирающимися латерально от средней линии до непосредственно над задней конечностью и ниже передней конечности.
Используйте щипцы Graefe, чтобы отшелушить мускулатуру живота и обнажить брюшиные внутренние органы. Используйте пару щипцов номер пять, чтобы поднять кишечник из висцеральной полости, чтобы выявить брыжеечный жировой слой. Используйте изогнутые ножницы и номер пять щипцов, чтобы отделить жировую часть вдоль толстой кишки, начиная от слепой кишки до того места, где толстая кишка опускается из поля зрения.
Затем отделите жировую массу вдоль тонкой кишки до поджелудочной железы. Удалить небольшую часть поджелудочной железы, чтобы полностью выделить брыжеечный жировой слой. Хранить изолированный брыжеечный жировой слой в буфере HEPES на льду.
Чтобы изолировать артерии, сначала переложите жировую ткань в рассекающую посуду, содержащую 10 миллилитров холодного буфера HEPES. Под стереомикроскопом расположите подкожную жировую клетчатку, чтобы обнажить пару вен артерии. Расположите висцеральную жировую ткань, чтобы обнажить форму цветной капусты и соответствующую пару вен артерии.
Используйте щипцы No 55, чтобы аккуратно удалить паренхиматозный жировой слой из артерии. Удаляйте небольшие кусочки жировой массы за один раз, не повреждая интересующие вас сосуды. Продолжайте до тех пор, пока артерии полностью не исчезнут из паренхиматозной жировой ткани.
Используйте щипцы номер пять, чтобы перенести очищенные артерии в новую трубку со свежим буфером HEPES, и держите на льду до готовности к пищеварению. Во-первых, добавьте по одному миллиграмму диспазы и эластазы в двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку. Добавьте два миллилитра диссоциационного раствора, вихрь и инкубируйте при 37 градусах Цельсия до полного растворения.
Используйте щипцы номер пять для переноса очищенных артерий в соответствующие пробирки. Инкубируйте трубки при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа с легким перемешиванием путем инверсии каждые 10-15 минут. Тем временем добавьте один миллиграмм коллагеназы первого типа на образец в новые пробирки.
После инкубации дайте артериям осесть на дне трубки и переведите 500 микролитров буфера сверху в трубки, содержащие коллагеназу. Вихрь и верните этот раствор в соответствующие пробки. Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.
Убедитесь, что артерии разделяются на кусочки при встряхивании пробирки. Используя стеклянную пипетку, энергично тритурируйте переваренную ткань от 10 до 15 раз, чтобы механически диссоциировать клетки. Пропустите переваренные образцы через 70-микронный клеточный сетчатый фильтр или сетчатый фильтр проточной цитометрии для получения одноклеточных суспензий.
Центрифугируйте одноэлементную суспензию и удалите супернатант. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в одном миллилитре PBS с 5% BSA в течение 30 минут. Добавьте один микролитр пятна жизнеспособности клеток и инкубируйте в темноте в течение 30 минут.
Центрифугируйте клеточную суспензию и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 200 микролитрах PBS с 1% BSA. Добавляют первичные антитела, конъюгированные с CD31 и CD45, и инкубируют на коромысле в холодильнике в течение 15 минут. Промывайте клетки, добавляя один миллилитр PBS с 1% BSA непосредственно в клеточную суспензию.
Центрифугируют клеточную суспензию и повторно суспендируют гранулу в 200 микролитрах 1% формальдегида с 0,1% BSA. Накройте трубки алюминиевой фольгой и храните в холодильнике до готовности к проточной цитометрии. Клеточные препараты, полученные из переваренных подкожных жировых артерий, использовали для идентификации популяций эндотелиальных клеток с помощью проточной цитометрии.
CD31 положительные CD45 отрицательные клетки были идентифицированы как эндотелиальные клетки. Окрашивание жизнеспособности клеток позволяло идентифицировать только те жизнеспособные клетки, которые пережили протокол выделения и пищеварения до фиксации. Чтобы выявить различия в экспрессии мембранного белка и эндотелиальных клеток от различных сосудов жирового депо, изолированные клетки были исследованы на наличие транслоказы жирных кислот CD36.
CD36 положительные эндотелиальные клетки были идентифицированы в подкожном и брыжеечном жире. Количественная оценка экспрессии CD36 и подкожных и брыжеечных эндотелиальных клеток показала, что как процент эндотелиальных клеток, экспрессирующих CD36, так и интенсивность экспрессии CD36 были выше в подкожных эндотелиальных клетках. Крайне важно тщательно рассечь, идентифицировать и очистить артерии.
Самое главное, протокол пищеварения должен производить достаточный выход жизнеспособных клеток для последующих применений. После этой процедуры изолированная клеточная популяция может быть использована для применений, включая, но не ограничиваясь, электрофизиологией, молекулярным профилированием и генерацией первичной клеточной линии для скрининга лекарств in vitro.
