このプロトコルにより、研究者は目的の動脈を解剖し、血管細胞を分離して幅広い機能テストを実行できます。研究者は、さまざまな血管床と細胞タイプを調査して、血管細胞生物学と血管機能障害のメカニズムの知識を広げることができます。この方法は、基本的な血管細胞生物学、および疾患の動物モデルにおける血管細胞機能障害を調査する研究者に最も適しています。
消化プロトコルを最適化するために特別な注意を払う必要があります, 特に関心のある血管床がここに示されているものと異なる場合.まず、解剖ピンを使用してマウスを固定し、腹面に70%エタノールをスプレーします。鉗子を使用して性器の真上に皮膚を持ち上げ、皮膚を約2ミリメートルの小さな切開を行います。
ハサミの先端を切開部位に挿入し、最初の切開から始まり、胸骨の付け根まで頭蓋状に解剖する4〜5センチの長さの正中線切開を行います。前肢のすぐ下の正中線から横方向に伸びる1センチメートルの切開を行います。後肢と性器の間に斜めの1センチの切開を行います。
正中線の皮膚切開に沿って小さな切り込みを入れて、関連する結合組織を剥がし、皮下脂肪デポを露出させます。C字型の皮下脂肪組織と腹腔に垂直に走る動脈または静脈を特定します。性器近くのC字型の底から始めて、脂肪組織をそっとつかんで結合組織を露出させます。
結合組織に小さな切り込みを入れて脂肪を皮膚から分離し、露出した血管系を乱さないようにします。皮下脂肪組織が無傷で除去できるようになるまで、結合組織を解剖し続けます。露出した動脈を周囲の結合組織から慎重に分離します。
単離した皮下脂肪を氷上のHEPESバッファーに保存する。残りの後部皮下脂肪デポについて解剖を繰り返します。腸間膜脂肪デポを隔離するには、Graefe鉗子を使用して膀胱の上の薄い腹膜腔壁を持ち上げ、まっすぐなハサミを使用して小さな切開を行います。
腹膜腔壁をゆっくりと持ち上げ、まっすぐな虹彩はさみを切開部位に挿入します。膀胱から胸骨まで4〜5センチの切開を行います。次に、正中線から後肢のすぐ上、前肢の下まで横方向に伸びるまっすぐな虹彩はさみで、1センチメートルの水平切開を2回行います。
Graefe鉗子を使用して腹部の筋肉組織を剥がし、腹膜内臓を露出させます。5番の鉗子のペアを使用して腸を内臓腔から持ち上げ、腸間膜脂肪を明らかにします。湾曲したハサミと5番の鉗子を使用して、盲腸から結腸が視界から下降する場所まで、結腸に沿って脂肪を分離します。
次に、小腸に沿って脂肪を膵臓に分離します。膵臓のごく一部を取り除き、腸間膜脂肪を完全に分離します。単離された腸間膜脂肪を氷上のHEPESバッファーに保管します。
動脈を単離するには、まず脂肪組織を10ミリリットルの冷たいHEPESバッファーを含む解剖皿に移します。実体顕微鏡下で、皮下脂肪組織を配置して動脈静脈対を露出させます。内臓脂肪組織を配置して、カリフラワーの形状とそれぞれの動脈静脈のペアを露出させます。
55番の鉗子を使用して、実質脂肪を動脈から慎重に取り除きます。目的の血管系を損傷することなく、一度に脂肪の小片を取り除きます。動脈から実質脂肪組織が完全になくなるまで続けます。
5番の鉗子を使用して、洗浄した動脈を新鮮なHEPESバッファーを含む新しいチューブに移し、消化の準備ができるまで氷上に保ちます。まず、ディスパーゼとエラスターゼをそれぞれ1ミリグラムずつ2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに加えます。2ミリリットルの解離溶液、ボルテックスを加え、完全に溶解するまで摂氏37度でインキュベートします。
5番の鉗子を使用して、洗浄した動脈をそれぞれのサンプルチューブに移します。チューブを摂氏37度で1時間インキュベートし、10〜15分ごとに反転させて穏やかに攪拌します。それまでの間、サンプルごとに1ミリグラムのコラゲナーゼタイプを新しいチューブに追加します。
インキュベーション後、動脈をチューブの下部に定着させ、500マイクロリットルのバッファーを上部からコラゲナーゼを含むチューブに移します。ボルテックスし、この溶液をそれぞれのサンプルチューブに戻します。サンプルを摂氏37度で15分間インキュベートします。
サンプルチューブを振ると、動脈がバラバラに分離することを確認してください。ガラスピペットを使用して、消化された組織を10〜15回激しく粉砕し、細胞を機械的に解離させる。消化したサンプルを70ミクロンのセルストレーナーまたはフローサイトメトリーチューブストレーナーに通して、シングルセル懸濁液を取得します。
単一細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去する。細胞ペレットを5%BSAを含む1ミリリットルのPBSに30分間再懸濁します。1マイクロリットルの細胞生存率染色剤を加え、暗所で30分間インキュベートします。
細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを1%BSAを含む200マイクロリットルのPBSに再懸濁します。CD31およびCD45に結合した一次抗体を加え、冷蔵庫のロッカーで15分間インキュベートします。1%BSAを含む1ミリリットルのPBSを細胞懸濁液に直接加えて細胞を洗浄する。
細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを0.1%BSAを含む200マイクロリットルの1%ホルムアルデヒドに再懸濁します。チューブをアルミホイルで覆い、フローサイトメトリーの準備ができるまで冷蔵庫に保管します。消化された皮下脂肪動脈から得られた細胞調製物を使用して、フローサイトメトリーを用いて内皮細胞集団を同定した。
CD31陽性CD45陰性細胞は内皮細胞として同定された。細胞生存率染色により、固定前に単離および消化プロトコルを生き延びた生存細胞のみを同定することができました。異なる脂肪デポー血管系からの膜タンパク質発現および内皮細胞の違いを同定するために、単離された細胞を脂肪酸トランスロカーゼCD36についてプローブした。
CD36陽性内皮細胞は、皮下脂肪および腸間膜脂肪において同定された。CD36発現と皮下および腸間膜内皮細胞の定量により、CD36を発現する内皮細胞の割合とCD36発現の強度の両方が皮下内皮細胞で大きいことが明らかになりました。動脈を注意深く解剖し、特定し、きれいにすることが重要です。
最も重要なことは、消化プロトコルは、ダウンストリームアプリケーションのために十分な収量の生細胞を生成する必要があります。この手順に続いて、単離された細胞集団は、電気生理学、分子プロファイリング、およびインビトロでの薬物スクリーニングのための初代細胞株の生成を含むがこれらに限定されない用途に使用することができる。
