Este protocolo demuestra la interrupción mecánica de los elegans marinos. En un formato de 96 pocillos que permite la cuantificación de rendimiento medio de la carga bacteriana en gusanos individuales. Esta técnica aumenta la velocidad y la uniformidad de la interrupción mecánica en comparación con los métodos basados en Pasel, lo que permite a los investigadores producir fácilmente conjuntos de datos más grandes de mediciones de gusanos individuales de alta calidad.
Esta técnica involucra muchas partes móviles y es fácil perder su lugar. Asegúrese de tener todos los materiales, tubos etiquetados, tampones y placas configurados antes de comenzar. Demostrando el procedimiento estará Megan Taylor, una especialista en investigación líder de mi laboratorio.
Comience por volver a suspender la muestra de gusano en un mililitro de M nueve TX cero uno en un tubo de microcentrífuga. Recoger los gusanos adultos por centrifugación y desechar el sobrenadante. Utilizando los mismos parámetros de centrifugación.
Enjuague los gusanos dos veces con un mililitro de M9TX01 y una vez con un mililitro de tampón de gusano M9, para minimizar las bacterias externas. Luego, vuelva a suspender cada muestra en un mililitro de medio S más dos x calor matado OP50 en un tubo de cultivo. Incubar los tubos a 25 grados centígrados durante 20 a 30 minutos para eliminar las bacterias no adheridas del intestino.
Después de la incubación, enjuague los gusanos purgados dos veces con un mililitro de M9TX01 frío y deseche el súper nadante. Coloque los tubos en hielo durante 10 minutos para paralizar los gusanos. Luego agregue un mililitro de tampón de gusanos M nueve helado con lejía sin perfume a cada tubo.
Incubar los tubos en hielo durante un mínimo de 10 minutos para matar las bacterias externas. Deseche el tampón de lejía y devuelva los tubos al hielo para evitar que los gusanos bombeen. A continuación, agregue un mililitro de M9TX01 frío a cada tubo y centrifugar durante cinco segundos.
En una mini centrífuga. Devuelva los tubos al hielo y retire el sobrenadante. Repita este paso una vez.
Para la permeabilización química de la cutícula del gusano. Transfiera los tubos que contienen los gusanos en 20 microlitros de tampón a una rejilla de tubos a temperatura ambiente. Luego agregue 100 microlitros de solución SDS / DTT a cada muestra caliente.
Incubar los tubos durante un máximo de ocho minutos en el banco para descomponer parcialmente la cutícula de los gusanos adultos. En este punto, los gusanos morirán y se asentarán en el fondo del tubo. Después de la incubación, deseche con cuidado el sobrenadante SDS/DTT.
Luego, agregue un mililitro de M9TX01 a cada tubo y centrifugar brevemente para granular los gusanos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los gusanos en un mililitro M nueve sin tampón de gusanos con 0,1% Triton x-100. Para prepararse para la interrupción mecánica de los gusanos, obtenga una placa estéril de pozo de 96 pozos de dos mililitros de profundidad y una cubierta de placa de silicona.
Use una espátula de cuchara estéril para agregar una pequeña cantidad de carburo de silicona de rejilla 36 estéril a cada pocillo de modo que la rejilla apenas cubra el fondo del pozo. Agregue 180 microlitros de amortiguador de lombriz M nueve a cada pocillo. Etiquete las columnas y filas y luego cubra la placa holgadamente con la cubierta de la placa de silicona.
A continuación, transfiera los gusanos permeabilizados a una pequeña placa de Petri con M9TX01 llena hasta una profundidad de un centímetro. Usando un microscopio de disección, pipetea gusanos individuales en volúmenes de 20 microlitros y transfiérelos a pocillos individuales de la placa de 96 pocillos para expulsar cualquier gusano pegado a la pipeta, aspire 20 microlitros de M9TX01 de un área clara de la placa de Petri y suéltelo de nuevo en el plato. Una vez que se transfieran todos los gusanos, cubra la placa de 96 pocillos con una lámina de película de techo flexible con el lado del papel hacia abajo sobre los pocillos de muestra.
Coloque la alfombra de techo de silicona ligeramente encima de la película de techo flexible sin presionar la cubierta hacia abajo en los pozos. Coloque la placa a cuatro grados centígrados durante 30 a 60 minutos para evitar el sobrecalentamiento durante la interrupción. Después de enfriar la placa, presione la estera de silicona del techo firmemente en los pozos para sellarlos.
Luego asegure las placas en el disruptor tisular. Agite los platos durante un minuto a 30 hercios. Luego gire las placas 180 grados y repita agitar durante un minuto.
Golpee las placas firmemente en el banco dos o tres veces para desalojar cualquier grano de la película flexible del techo. Centrifugar el conjunto de placas 2, 400 veces G durante dos minutos para recoger las muestras en el fondo de los pozos. Luego retire la tapa de silicona y retire la película del techo.
Para preparar una dilución en serie diez veces mayor de los digeridos de gusanos, llene 180 microlitros de un PBS X en las filas B a D de una placa de 96 pocillos. Usando un pipeter de varios pocillos ajustado a 200 microlitros, mezcle lentamente la digestión del gusano con pipeteo. Transfiera la cantidad máxima del líquido a la fila A de la placa de 96 pocillos que contiene PBS.
Con una pipeta multicanal, retire 20 microlitros de la fila superior y dispense en la fila B.Seguido de la mezcla. Repita este paso para la fila B a C y luego la fila C a D para obtener una dilución de 1000 veces para la cuantificación bacteriana de gusanos monocolonizados. Placa de 10 a 20 microlitros de cada dilución en placas de agar sólido.
Para la colonización multiespecie, placa 100 microlitros de cada dilución en placas de agar de 10 centímetros. Usando este protocolo, se observó una desinfección externa efectiva después del blanqueamiento superficial de gusanos paralizados por frío, como se ve por la disminución de bacterias externas en el amortiguador. Sin afectar a las bacterias asociadas al intestino.
La interrupción manual de los gusanos dio lugar a una mayor heterogeneidad. La arena de carburo de silicona era ideal para la disrupción con o sin Tri Andex. En el método de 96 pozos, las cuentas de vidrio grandes no eran adecuadas para la técnica de 96 pozos.
Las pequeñas perlas de vidrio produjeron resultados consistentes pero obstruyeron la tubería en la punta. Los gusanos colonizados en el mismo grupo de bacterias mostraron una alta variación en la carga intestinal cuando se observaron para bacterias individuales y comunidades bacterianas de múltiples especies. Los gusanos colonizados con bacterias que expresan GFP, mostraron heterogeneidad en las mediciones individuales de gusanos.
Para esta cepa bacteriana GFP que expresa la colonización de Bristol Len de tipo salvaje con dos gusanos. Para DAF, dos mutantes de IGF mostraron que el mutante DAF 16 admite poblaciones más grandes de bacterias, mientras que DAF dos es resistente a la colonización. Esta heterogeneidad fue característica y consistente en diferentes ejecuciones del mismo experimento.
Se encontró que el remuestreo de datos para simular resúmenes por lotes alteraba la distribución en comparación con los datos de gusanos individuales. El lote extrapolado de UFC por gusano se centró en la media aritmética de los datos individuales que conducen a la pérdida de variación biológica. En lugar de proceder a digerir lejía de superficie viva y enjuagar, los gusanos se pueden usar para experimentos adicionales.
El movimiento se reanudará rápidamente una vez que los gusanos se eliminen del frío.
