このプロトコルは、海のエレガンスの機械的破壊を示しています。96ウェルフォーマットで、個々のワームの細菌負荷を中程度のスループットで定量化できます。この手法は、Paselベースの方法と比較して、機械的破壊の速度と均一性を向上させ、研究者が高品質のシングルワーム測定のより大きなデータセットを簡単に作成できるようにします。
このテクニックには多くの可動部品が含まれており、場所を失うのは簡単です。開始する前に、すべての材料、ラベル付きチューブ、バッファー、プレートがセットアップされていることを確認してください。手順を実演するのは、私の研究室の研究スペシャリストリーダーであるミーガンテイラーです。
まず、ワームサンプルをマイクロ遠心チューブ内の1ミリリットルのM nine TX zero oneに再懸濁します。成虫を遠心分離で回収し、上清を廃棄する。同じ遠心分離パラメータを使用する。
外部細菌を最小限に抑えるために、1ミリリットルのM9TX01で2回、1ミリリットルのM9ワームバッファーで1回、ワームをすすぎます。次に、各サンプルを1ミリリットルのS培地に2倍の熱死体OP50を加えた培養チューブに再懸濁します。チューブを摂氏25度で20〜30分間インキュベートして、非広告付着細菌を腸から通過させます。
インキュベーション後、パージしたワームを1ミリリットルの冷たいM9TX01で2回すすぎ、上清を捨てます。ワームを麻痺させるために10分間チューブを氷の上に置きます。次に、無香料の漂白剤を含む1ミリリットルの氷冷Mナインワームバッファーを各チューブに追加します。
チューブを氷上で最低10分間インキュベートして、外部のバクテリアを殺します。漂白剤バッファーを廃棄し、チューブを氷に戻して、ワームがポンピングするのを防ぎます。次に、各チューブに1ミリリットルの冷たいM9TX01を加え、5秒間遠心分離します。
ミニ遠心分離機で。チューブを氷に戻し、上清を取り除きます。この手順を一度繰り返します。
ワームキューティクルの化学透過処理用。20マイクロリットルのバッファーに入ったワームを含むチューブを室温のチューブラックに移します。次に、各ウォームサンプルに100マイクロリットルのSDS / DTT溶液を追加します。
成虫のキューティクルを部分的に分解するためにベンチで最大8分間チューブをインキュベートします。この時点で、ワームは死んでチューブの底に落ち着きます。インキュベーション後、SDS/DTT上清を注意深く廃棄します。
次に、各チューブに1ミリリットルのM9TX01を追加し、短時間遠心分離してワームをペレット化します。上清を廃棄し、0.1%Triton x-100を含む1ミリリットルのM 9ワームバッファーにワームを再懸濁します。ワームの機械的破壊に備えるために、滅菌2ミリリットルの深さのウェル96ウェルプレートとシリコンプレートカバーを入手してください。
滅菌スクープスヘラを使用して、グリッドがウェルの底をかろうじて覆うように、少量の滅菌36グリッド炭化物を各ウェルに追加します。180マイクロリットルのM 9ワームバッファーを各ウェルに加えます。列と行にラベルを付けてから、シリコンプレートカバーでプレートをゆるく覆います。
次に、透過処理したワームを、M9TX01を1センチメートルの深さまで満たした小さなペトリ皿に移します。解剖顕微鏡を使用して、20マイクロリットルの容量の個々のワームをピペットで取り出し、96ウェルプレートの個々のウェルに移して、ピペットに付着したワームを排出し、ペトリ皿の透明な領域から20マイクロリットルのM9TX01を吸引し、皿に戻します。すべてのワームが移されたら、96ウェルプレートを柔軟な天井フィルムのシートで覆い、紙の裏面をサンプルウェルに下に向けています。
カバーをウェルに押し下げることなく、シリコンシーリングマットをフレキシブルシーリングフィルムの上に軽く置きます。中断中の過熱を防ぐために、プレートを摂氏4度で30〜60分間置きます。プレートを冷やした後、シリコンシーリングマットをウェルにしっかりと押し下げて密閉します。
次に、プレートを組織破壊剤に固定します。プレートを30ヘルツで1分間振とうします。次に、プレートを180度回転させ、1分間振とうを繰り返します。
プレートをベンチに2〜3回しっかりと叩いて、柔軟な天井フィルムから砂を取り除きます。プレートセットを2、400回Gで2分間遠心分離し、ウェルの底にサンプルを回収した。次に、シリコンの蓋を外し、天井フィルムを引き剥がします。
ワームダイジェストの10倍段階希釈を調製するには、96ウェルプレートの行BからDに180マイクロリットルの1X PBSを充填します。200マイクロリットルに設定されたマルチウェルピペッターを使用して、ピペッティングによってワームダイジェストをゆっくりと混合します。最大量の液体をPBSを含む96穴プレートのA列に移す。
マルチチャンネルピペットを使用して、一番上の列から20マイクロリットルを取り出し、列Bに分注し、続いて混合します。この手順を行BからC、次に行CからDに対して繰り返して、モノコロニー化ワームの細菌定量用に1000倍希釈します。プレート10〜20マイクロリットルの各希釈液を固体寒天プレート上に。
複数種のコロニー形成のために、各希釈液100マイクロリットルを10センチメートル寒天プレートにプレートする。このプロトコルを使用すると、バッファー中の外部細菌の減少に見られるように、低温麻痺ワームの表面漂白後に効果的な外部消毒が観察されました。腸関連細菌に影響を与えることなく。
ワームを手動で中断すると、異質性が高まりました。シリコーンカーバイドグリットは、Tri Andexの有無にかかわらず、破壊に理想的でした。96ウェル法では、大きなガラスビーズは96ウェル法には適していませんでした。
小さなガラスビーズは一貫した結果を生み出しましたが、先端のパイプを詰まらせました。同じ細菌のプールにコロニーを形成した線虫は、個々の細菌および複数種の細菌群集について観察された場合、腸内負荷の高い変動を示しました。GFPを発現する細菌でコロニーを形成したワームは、個々のワーム測定において不均一性を示した。
このGFP発現細菌株について、野生型ブリストルレン2匹の虫のコロニー形成を比較した。DAFに対して2つのIGF変異体は、DAF 16変異体が細菌のより大きな集団をサポートするのに対し、DAF 2はコロニー形成に対して耐性であることを示した。この異質性は特徴的であり、同じ実験の異なる実行にわたって一貫していました。
バッチダイジェストをシミュレートするためのデータの再サンプリングは、個々のワームデータと比較して分布を変更することがわかりました。ワームごとのバッチ外挿CFUは、生物学的変動の損失につながる個々のデータの算術平均を中心にしていました。生きた表面漂白剤の消化に進む代わりに、ワームをすすぎ、さらなる実験に使用することができます。
ワームが寒さから取り除かれると、動きはすぐに再開されます。
