Ce protocole démontre la perturbation mécanique des elegans de mer. Dans un format de 96 puits permettant une quantification à débit moyen de la charge bactérienne dans les vers individuels. Cette technique augmente la vitesse et l’uniformité de la perturbation mécanique par rapport aux méthodes basées sur Pasel, ce qui permet aux chercheurs de produire facilement de plus grands ensembles de données de mesures de haute qualité sur un seul ver.
Cette technique implique de nombreuses pièces mobiles et il est facile de perdre votre place. Assurez-vous d’avoir tous les matériaux, tubes étiquetés, tampons et plaques installés avant de commencer. La démonstration de la procédure sera assurée par Megan Taylor, une spécialiste de la recherche responsable de mon laboratoire.
Commencez par remettre en suspension l’échantillon de vis sans fin dans un millilitre de M neuf TX zéro un dans un tube microcentrifugé. Recueillir les vers adultes par centrifugation et jeter le surnageant. En utilisant les mêmes paramètres de centrifugation.
Rincez les vers deux fois avec un millilitre de M9TX01 et une fois avec un millilitre de tampon de ver M9, pour minimiser les bactéries externes. Ensuite, remettre en suspension chaque échantillon dans un millilitre de milieu S plus deux x OP50 tué par la chaleur dans un tube de culture. Incuber les tubes à 25 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour évacuer les bactéries non adhérées à la MA de l’intestin.
Après l’incubation, rincer les vers purgés deux fois avec un millilitre de M9TX01 froid et jeter le super natant. Mettez les tubes sur de la glace pendant 10 minutes pour paralyser les vers. Ajoutez ensuite un millilitre de tampon de vers M neuf glacés avec de l’eau de Javel non parfumée à chaque tube.
Incuber les tubes sur de la glace pendant au moins 10 minutes pour tuer les bactéries externes. Jetez le tampon d’eau de Javel et remettez les tubes dans la glace pour empêcher les vers de pomper. Ensuite, ajoutez un millilitre de M9TX01 froid à chaque tube et centrifugez pendant cinq secondes.
Dans une mini centrifugeuse. Remettez les tubes sur la glace et retirez le surnageant. Répétez cette étape une fois.
Pour la perméabilisation chimique de la cuticule du vers. Transférer les tubes contenant les vers dans 20 microlitres de tampon dans une grille à tubes à température ambiante. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution SDS/DTT à chaque échantillon chaud.
Incuber les tubes jusqu’à huit minutes sur le banc pour décomposer partiellement la cuticule des vers adultes. À ce stade, les vers mourront et s’installeront au fond du tube. Après l’incubation, jetez soigneusement le surnageant SDS/DTT.
Ensuite, ajoutez un millilitre de M9TX01 à chaque tube et centrifugez brièvement pour enduire les vers. Jeter le surnageant et remettre les vers en suspension dans un tampon de neuf vers M d’un millilitre avec 0,1% Triton x-100. Pour vous préparer à la perturbation mécanique des vers, procurez-vous une plaque stérile de puits 96 de deux millilitres de profondeur et un couvercle de plaque de silicone.
Utilisez une spatule à cuillère stérile pour ajouter une petite quantité de carbure de silicone stérile à grille 36 à chaque puits, de sorte que la grille recouvre à peine le fond du puits. Ajouter 180 microlitres de tampon de vers M nine à chaque puits. Étiquetez les colonnes et les rangées, puis couvrez la plaque lâchement avec le couvercle de la plaque en silicone.
Ensuite, transférez les vers perméabilisés dans une petite boîte de Petri remplie de M9TX01 jusqu’à une profondeur d’un centimètre. À l’aide d’une pipette de microscope disséquante, éliminez les vers individuels dans des volumes de 20 microlitres et transférez-les dans des puits individuels de la plaque de 96 puits pour éjecter tous les vers collés à la pipette, aspirez 20 microlitres de M9TX01 d’une zone dégagée de la boîte de Petri et relâchez-le dans la parabole. Une fois tous les vers transférés, recouvrez la plaque de 96 puits avec une feuille de film de plafond flexible avec le côté du dos en papier vers le bas sur les puits d’échantillonnage.
Placez légèrement le tapis de plafond en silicone sur le film de plafond flexible sans appuyer sur le couvercle dans les puits. Placez la plaque à quatre degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes pour éviter la surchauffe pendant les perturbations. Après avoir refroidi la plaque, appuyez fermement sur le tapis de plafond en silicone dans les puits pour les sceller.
Ensuite, fixez les plaques dans le perturbateur tissulaire. Secouez les assiettes pendant une minute à 30 hertz. Ensuite, faites pivoter les plaques de 180 degrés et répétez les secousses pendant une minute.
Tapotez fermement les plaques sur le banc deux ou trois fois pour déloger tout grain du film flexible du plafond. Centrifuger la plaque réglée 2 400 fois G pendant deux minutes pour prélever les échantillons au fond des puits. Ensuite, retirez le couvercle en silicone et retirez le film de plafond.
Pour préparer une dilution en série décuplée des digestions de vers, remplir 180 microlitres d’un X PBS dans les rangées B à D d’une plaque de 96 puits. À l’aide d’un pipeter multipuits réglé à 200 microlitres, mélangez lentement la digestion du ver par pipetage. Transférer la quantité maximale de liquide à la rangée A de la plaque de 96 puits contenant du PBS.
À l’aide d’une pipette multicanal, retirer 20 microlitres de la rangée supérieure et distribuer dans la rangée B.Suivi d’un mélange. Répétez cette étape pour la rangée B à C, puis la ligne C à D pour obtenir une dilution de 1000 fois Pour la quantification bactérienne des vers monocolonisés. Plaquette 10 à 20 microlitres de chaque dilution sur gélose solide.
Pour la colonisation multi-espèces, plaquez 100 microlitres de chaque dilution sur des plaques de gélose de 10 centimètres. À l’aide de ce protocole, une désinfection externe efficace a été observée après le blanchiment de surface des vers paralysés à froid, comme en témoigne le déclin des bactéries externes dans le tampon. Sans affecter les bactéries associées à l’intestin.
La perturbation manuelle des vers a entraîné une plus grande hétérogénéité. Le grain en carbure de silicone était idéal pour les perturbations avec ou sans Tri Andex. Dans la méthode des 96 puits, les grosses billes de verre ne convenaient pas à la technique des 96 puits.
Les petites perles de verre produisaient des résultats cohérents, mais obstruaient le tuyau à l’extrémité. Les vers colonisés sur le même groupe de bactéries ont montré une forte variation de la charge intestinale lorsqu’ils ont été observés pour des bactéries individuelles et des communautés bactériennes multi-espèces. Les vers colonisés par des bactéries exprimant la GFP ont montré une hétérogénéité dans les mesures individuelles des vers.
Pour cette souche bactérienne exprimant GFP comparant la colonisation de type sauvage Bristol Len deux vers. Pour DAF, deux mutants IGF ont montré que le mutant DAF 16 soutient de plus grandes populations de bactéries, tandis que DAF deux est résistant à la colonisation. Cette hétérogénéité était caractéristique et constante au cours des différentes séries d’une même expérience.
On a constaté que le rééchantillonnage des données pour simuler les résumés par lots modifiait la distribution par rapport aux données individuelles sur les vers. Le lot extrapolé UFC par ver était centré autour de la moyenne arithmétique des données individuelles, ce qui entraînait une perte de variation biologique. Au lieu de procéder à la digestion de l’eau de Javel et de rinçage de surface vivante, les vers peuvent être utilisés pour d’autres expériences.
Le mouvement reprendra rapidement une fois que les vers seront retirés du froid.
