Этот протокол демонстрирует механическое разрушение морских элеганов. В формате 96 лунок, позволяющем среднюю пропускную способность количественно определять бактериальную нагрузку у отдельных червей. Этот метод увеличивает скорость и однородность механических разрушений по сравнению с методами, основанными на Паселе, что позволяет исследователям легко создавать большие наборы данных высококачественных измерений одного червя.
Эта техника включает в себя множество движущихся частей, и легко потерять свое место. Убедитесь, что у вас есть все материалы, маркированные трубки, буферы и пластины, установленные перед началом. Продемонстрировать процедуру будет Меган Тейлор, специалист-исследователь из моей лаборатории.
Начните с повторной приостановки образца червя в одном миллилитре M девять TX ноль один в микроцентрифужной трубке. Соберите взрослых червей путем центрифугирования и выбросьте супернатант. Использование тех же параметров центрифугирования.
Промыть червей дважды одним миллилитром M9TX01 и один раз одним миллилитром червячного буфера M9, чтобы свести к минимуму внешние бактерии. Затем повторно суспендировать каждый образец в одном миллилитре S-среды плюс два x термоубитых OP50 в культуральной трубке. Инкубируйте трубки при температуре 25 градусов цельсия в течение 20-30 минут, чтобы пропустить неприлипшие бактерии из кишечника.
После инкубации дважды промойте очищенных червей одним миллилитром холодного M9TX01 и выбросьте супернатант. Положите трубки на лед на 10 минут, чтобы парализовать червей. Затем добавьте один миллилитр ледяного холода M девять червячного буфера с неароматизированным отбеливателем в каждую трубку.
Инкубируйте трубки на льду в течение минимум 10 минут, чтобы убить внешние бактерии. Выбросьте буфер отбеливателя и верните трубки на лед, чтобы предотвратить откачку червей. Затем добавьте по одному миллилитру холодного M9TX01 к каждой трубке и центрифуге в течение пяти секунд.
В мини-центрифуге. Верните трубки в лед и удалите супернатант. Повторите этот шаг один раз.
Для химической пермеабилизации кутикулы червя. Перенесите трубки, содержащие червей, в 20 микролитрах буфера в стойку трубки комнатной температуры. Затем добавьте 100 микролитров раствора SDS/DTT к каждому теплому образцу.
Высиживайте трубки до восьми минут на скамейке, чтобы частично разрушить кутикулу взрослых червей. В этот момент черви погибнут и осядут на дне трубки. После инкубации осторожно выбросьте супернатант SDS/DTT.
Затем добавьте по одному миллилитру M9TX01 в каждую трубку и ненадолго центрифугируйте червей. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте червей в одном миллилитре M девять червячного буфера с 0,1% Triton x-100. Чтобы подготовиться к механическому разрушению червей, получают стерильную двухмиллилитровую скважинную пластину глубиной 96 скважин и силиконовую пластинчатую крышку.
Используйте стерильный совковый шпатель, чтобы добавить небольшое количество стерильного 36-ти сетчатого карбида силикона в каждую лунку таким образом, чтобы сетка едва закрывала дно колодца. Добавьте 180 микролитров червячного буфера M nine в каждую лунку. Пометьте колонны и ряды, а затем накройте пластину свободно силиконовой крышкой пластины.
Далее переложите пермеабилизированных червей в небольшую чашку Петри с заполненной на глубину до одного сантиметра. С помощью рассекающего микроскопа пипетку вынимают отдельных червей в объемах 20 микролитров и переносят их в отдельные колодцы пластины 96 скважин, чтобы извлечь любых червей, прилипших к пипетке, аспирировать 20 микролитров M9TX01 из чистой области чашки Петри и выпустить ее обратно в чашку. После переноса всех червей накройте плиту из 96 скважин листом гибкой потолочной пленки с бумажной стороной, обращенной вниз к колодцам для образцов.
Поместите силиконовый потолочный коврик слегка поверх гибкой потолочной пленки, не прижимая крышку к колодцам. Поместите пластину при четырех градусах Цельсия на 30-60 минут, чтобы предотвратить перегрев во время разрушения. После охлаждения пластины плотно прижмите силиконовый потолочный мат к колодцам, чтобы запечатать их.
Затем закрепите пластины в тканевом разрушителе. Встряхните тарелки в течение одной минуты при 30 герцах. Затем поверните пластины на 180 градусов и повторите встряхивание в течение одной минуты.
Плотно постучите по плитам на скамейке два или три раза, чтобы выбить песок из гибкой потолочной пленки. Центрифугу пластины устанавливают 2, 400 раз G в течение двух минут для сбора проб на дне скважин. Затем снимите силиконовую крышку и снимите потолочную пленку.
Чтобы подготовить десятикратное последовательное разведение червячных дайджестов, заполните 180 микролитров одного X PBS в ряды от B до D 96-луночной пластины. Используя многолуночный пипетку, установленную на 200 микролитров, медленно перемешайте переваривание червя путем пипетирования. Перенесите максимальное количество жидкости в ряд А плиты 96 скважин, содержащей PBS.
Используя многоканальную пипетку, удалите 20 микролитров из верхнего ряда и распределите в ряд B. С последующим смешиванием. Повторите этот шаг для строк B до C, а затем от строки C до D, чтобы получить 1000-кратное разбавление для бактериальной количественной оценки моноколонизированных червей. Пластина от 10 до 20 микролитров каждого разведения на твердых агаровых пластинах.
Для многовидовой колонизации наносят по 100 микролитров каждого разведения на 10-сантиметровые агаровые пластины. Используя этот протокол, эффективная внешняя дезинфекция наблюдалась после поверхностного обесцвечивания холодных парализованных червей, что видно по снижению внешних бактерий в буфере. Не затрагивая кишечные ассоциированные бактерии.
Ручное разрушение червей приводило к большей неоднородности. Твердосплавная крупа силикона идеально подходила для разрушения с Tri Andex или без него. В методе 96 скважин большие стеклянные бусины не подходили для техники 96 скважин.
Небольшие стеклянные бусины давали стабильные результаты, но забивали трубу на кончике. Черви, колонизированные в одном пуле бактерий, показали высокие различия в кишечной нагрузке при наблюдении за отдельными бактериями и многовидовыми бактериальными сообществами. Черви, колонизированные бактериями, экспрессирующими GFP, показали гетерогенность в отдельных измерениях червей.
Для этого GFP экспрессирующий бактериальный штамм сравнивают колонизацию дикого типа Bristol Len двумя червями. Для DAF два мутанта IGF показали, что мутант DAF 16 поддерживает большие популяции бактерий, в то время как DAF два устойчивы к колонизации. Эта неоднородность была характерной и последовательной для разных запусков одного и того же эксперимента.
Было обнаружено, что повторная выборка данных для моделирования пакетных дайджестов изменяет распределение по сравнению с отдельными данными о червях. Пакетная экстраполированная КОЕ на червя была сосредоточена вокруг среднего арифметического отдельных данных, что привело к потере биологической изменчивости. Вместо того, чтобы приступать к перевариванию живой поверхности отбеливателя и полоскания, черви могут быть использованы для дальнейших экспериментов.
Движение быстро возобновится, как только черви будут удалены с холода.
