이 프로토콜은 바다 엘레 간스의 기계적 파괴를 보여줍니다. 96 웰 형식으로 개별 웜에서 박테리아 부하의 중간 처리량 정량화가 가능합니다. 이 기술은 Pasel 기반 방법에 비해 기계적 파괴의 속도와 균일성을 높여 연구원이 고품질 단일 웜 측정의 더 큰 데이터 세트를 쉽게 생성할 수 있도록 합니다.
이 기술은 많은 움직이는 부품을 포함하며 자리를 잃기 쉽습니다. 시작하기 전에 모든 재료, 라벨이 붙은 튜브, 버퍼 및 플레이트가 설정되어 있는지 확인하십시오. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 전문가 인 Megan Taylor가 될 것입니다.
웜 샘플을 마이크로 원심분리 튜브에서 M9TX제로 1의 1 밀리리터에 재현탁시키는 것으로 시작한다. 원심분리에 의해 성충을 수집하고 상청액을 버린다. 동일한 원심분리 파라미터 사용.
외부 박테리아를 최소화하기 위해 1 밀리리터의 M9TX01로 웜을 두 번, M9 웜 버퍼 1 밀리리터로 한 번 헹굽니다. 그런 다음 각 샘플을 1 밀리리터의 S 배지에 2 x 열 사멸 OP50을 배양 튜브에 다시 현탁시킵니다. 튜브를 섭씨 25도에서 20-30 분 동안 배양하여 부착되지 않은 박테리아를 장에서 통과시킵니다.
배양 후, 퍼지 된 웜을 차가운 M9TX01 1 밀리리터로 두 번 헹구고 상아 액을 버립니다. 튜브를 얼음 위에 10 분 동안 올려 벌레를 마비시킵니다. 그런 다음 무향 표백제가 함유 된 얼음처럼 차가운 M 9 웜 버퍼 1 밀리리터를 각 튜브에 첨가하십시오.
외부 박테리아를 죽이기 위해 튜브를 얼음 위에 최소 10분 동안 배양합니다. 표백제 버퍼를 버리고 튜브를 얼음으로 되돌려 벌레가 펌핑되는 것을 방지합니다. 다음으로 차가운 M9TX01 1 밀리리터를 각 튜브에 넣고 5 초 동안 원심 분리합니다.
미니 원심 분리기에서. 튜브를 얼음으로 되돌리고 상층액을 제거하십시오. 이 단계를 한 번 반복합니다.
웜 큐티클의 화학 투과용. 20 마이크로 리터의 버퍼에 웜이 들어있는 튜브를 실온 튜브 랙으로 옮깁니다. 그런 다음 각 따뜻한 샘플에 100마이크로리터의 SDS/DTT 용액을 추가합니다.
튜브를 벤치에서 최대 8 분 동안 배양하여 성인 벌레의 표피를 부분적으로 분해하십시오. 이 시점에서 웜은 죽어 튜브 바닥에 정착합니다. 배양 후 SDS/DTT 상청액을 조심스럽게 폐기합니다.
그런 다음 각 튜브에 M9TX01 1밀리리터를 추가하고 잠시 원심분리하여 웜을 펠릿으로 만듭니다. 상청액을 버리고 0.1% Triton x-100으로 1밀리리터 M 9 웜 완충액에 웜을 다시 현탁시킨다. 웜의 기계적 파괴에 대비하려면 멸균 2 밀리리터 깊은 우물 96 웰 플레이트와 실리콘 플레이트 덮개를 확보하십시오.
멸균 스쿱 주걱을 사용하여 그리드가 우물 바닥을 거의 덮지 않도록 소량의 멸균 36 그리드 실리콘 카바이드를 각 웰에 첨가하십시오. 180 마이크로리터의 M 나인 웜 버퍼를 각 웰에 추가합니다. 기둥과 행에 레이블을 지정한 다음 실리콘 플레이트 덮개로 플레이트를 느슨하게 덮습니다.
다음으로, 투과 된 웜을 M9TX01이 1cm 깊이까지 채워진 작은 페트리 접시로 옮깁니다. 해부 현미경 피펫을 사용하여 20 마이크로 리터 부피의 개별 웜을 제거하고 96 웰 플레이트의 개별 웰로 옮겨 피펫에 붙어있는 웜을 꺼내고 페트리 접시의 깨끗한 영역에서 20 마이크로 리터의 M9TX01을 흡인하여 접시에 다시 놓습니다. 모든 웜이 옮겨지면 96 웰 플레이트를 유연한 천장 필름 시트로 덮고 종이를 받쳐서 샘플 웰을 아래로 향하게합니다.
덮개를 우물에 누르지 않고 유연한 천장 필름 위에 실리콘 천장 매트를 가볍게 놓습니다. 중단 중 과열을 방지하기 위해 플레이트를 섭씨 4도에서 30-60분 동안 두십시오. 플레이트를 식힌 후 실리콘 천장 매트를 우물에 단단히 눌러 밀봉합니다.
그런 다음 조직 파괴 물질에 플레이트를 고정하십시오. 플레이트를 30헤르츠에서 1분 동안 흔듭니다. 그런 다음 플레이트를 180도 회전하고 1 분 동안 흔들기를 반복하십시오.
벤치의 판을 두세 번 세게 두드려 유연한 천장 필름에서 모래를 제거합니다. 플레이트를 2분 동안 2, 400회 G로 원심분리하여 웰의 바닥에서 샘플을 수집한다. 그런 다음 실리콘 뚜껑을 제거하고 천장 필름을 잡아 당깁니다.
웜 다이제스트의 10배 연속 희석을 준비하려면 180마이크로리터의 1X PBS를 96웰 플레이트의 행 B에서 D로 채웁니다. 200 마이크로리터로 설정된 멀티웰 피펫터를 사용하여, 웜 다이제스트를 피펫팅으로 천천히 혼합한다. 액체의 최대량을 PBS를 함유하는 96 웰 플레이트의 행 A로 옮긴다.
다중 채널 피펫을 사용하여 맨 위 줄에서 20 마이크로 리터를 제거하고 B 열에 분주합니다. 행 B에서 C까지, 다음 행 C에서 D에 대해 이 단계를 반복하여 모노 식민지 웜의 박테리아 정량화를 위한 1000배 희석을 얻습니다. 각 희석액 10 내지 20 마이크로리터를 고체 한천 플레이트 상에 플레이트한다.
다종 집락화의 경우, 10 센티미터 한천 플레이트에 각 희석액 100 마이크로 리터를 플레이트합니다. 이 프로토콜을 사용하여 완충액에서 외부 박테리아의 감소로 볼 수 있듯이 차가운 마비 된 벌레의 표면 표백 후 효과적인 외부 살균이 관찰되었습니다. 장내 관련 박테리아에 영향을 미치지 않고.
웜의 수동 중단은 더 많은 이질성을 초래했습니다. 실리콘 카바이드 그릿은 Tri Andex의 유무에 관계없이 중단에 이상적이었습니다. 96 웰 방법에서 큰 유리 구슬은 96 웰 기술에 적합하지 않았습니다.
작은 유리 구슬은 일관된 결과를 생성했지만 끝 부분에서 파이프를 막았습니다. 동일한 박테리아 풀에 서식하는 벌레는 개별 박테리아와 다종 박테리아 군집에 대해 관찰되었을 때 장 부하의 높은 변화를 보였습니다. GFP를 발현하는 박테리아로 식민지화 된 웜은 개별 웜 측정에서 이질성을 보였습니다.
이러한 GFP 발현 박테리아 균주의 경우 야생형 브리스톨렌 2웜의 집락화를 비교하였다. DAF에 2개의 IGF 돌연변이체는 DAF 16 돌연변이체가 더 많은 박테리아 집단을 지원하는 반면, DAF2는 집락화에 내성이 있음을 보여주었다. 이 이질성은 동일한 실험의 다른 실행에서 특징적이고 일관되었습니다.
배치 다이제스트를 시뮬레이션하기 위한 데이터의 재샘플링은 개별 웜 데이터와 비교하여 분포를 변경하는 것으로 밝혀졌습니다. 웜 당 배치 외삽 된 CFU는 생물학적 변이의 손실로 이어지는 개별 데이터의 산술 평균을 중심으로 이루어졌습니다. 살아있는 표면 표백제를 소화하는 대신 헹굼 웜을 추가 실험에 사용할 수 있습니다.
추위에서 벌레가 제거되면 움직임이 빠르게 재개됩니다.
