Todos los organismos tienen desorden en su proteoma, estimado hasta un 33%Estas regiones son observables por espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio, pero solo en el rango de tiempo de milisegundos. Nuestro protocolo le mostrará cómo hacer esto con éxito. Esta es una técnica analítica totalmente automatizada.
Simplemente configura todo, programa las mediciones de tiempo deseadas, presiona ir y aléjate. Esta técnica abre la emocionante oportunidad de detectar compuestos que estabilicen confirmaciones específicas de proteínas intrínsecamente desordenadas como la alfa-sinucleína. Para comenzar la preparación de la muestra para el mapeo de péptidos, primero tome un vial de proteína alfa-sinucleína almacenada del congelador de menos 80 grados centígrados.
Y una vez descongelado, filtre con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. Luego mida la absorbancia de la solución a 218 nanómetros para determinar la concentración de proteína utilizando la ley de Beer-Lambert, y diluya la proteína con un tampón de equilibrio a una concentración final de cinco micromolares. A continuación, para configurar el robot de automuestreo, agregue 50 microlitros de la solución de proteína de cinco micromolares a un vial de recuperación total y coloque el vial en la posición de muestra en la cámara derecha del intercambio de hidrógeno / deuterio, o HDX, robótica en línea con el espectrómetro de masas.
Luego coloque un vial de tampón de equilibrio y dos viales de tampón de lavado de pepsina en las posiciones de reactivo uno, cuatro y cinco de las cámaras izquierdas y un vial de tampón de enfriamiento para colocar uno en la cámara derecha hdX y ajuste la temperatura a 20 grados Celsius usando el controlador de temperatura Peltier. A continuación, agregue un número igual de viales de recuperación total y viales de recuperación máxima en las mismas posiciones de reacción de la cámara izquierda HDX y la cámara derecha HDX, respectivamente. A continuación, configure una lista de ejemplo con los métodos LC y MS apropiados en el software de programación e inicie la programación.
Para obtener el mapa final de cobertura de péptidos, seleccione manualmente las asignaciones isotópicas en el software de análisis de datos DynamX HDX. Después de limpiar el prototipo de instrumento Fast HDX, abra la interfaz gráfica de usuario del software HDX compatible para inicializar el sistema. Introduzca 20 grados Celsius y 0,5 grados Celsius como temperaturas de la cámara de muestra y de la cámara de enfriamiento respectivamente, seguido de hacer clic en establecer para aplicar las nuevas temperaturas.
Para limpiar y preparar el instrumento, configure los tubos de la centrífuga con agua de grado LC / MS en todas las entradas, luego verifique las jeringas izquierda y derecha en la pestaña de entrega de plomería del valorador y continúe haciendo clic en la imprimación hasta que todas las burbujas de aire latentes en los tubos desaparezcan. Para marcar todas las casillas de jeringas, primero vaya a la pestaña macros y haga clic en calibrar jeringas en la posición de inicio, luego primero haga clic en el bucle de carga de la jeringa de lavado, seguido de lavar todos los volúmenes del bucle de mezcla. Si hay alguna burbuja en una jeringa tampón, desconecte la jeringa y desgasifá desgasificándola verticalmente.
Antes de recalibrar a la posición cero, reemplace la jeringa. Para configurar el prototipo de instrumento Fast HDX para experimentos HDX, primero inserte el tubo de entrada de valoración izquierdo en el vial de recuperación total. Para evitar la oligomerización y agregación inducida por la temperatura, coloque el tubo en un refrigerador de mesa.
A continuación, agregue 50 mililitros de equilibrio, etiquetado, enfriamiento y tampones de lavado de pepsina a las respectivas entradas de tampón en las cámaras derecha e izquierda del instrumento, seguido de agregar 50 mililitros de tampón de lavado de columna a la entrada de lavado de pepsina. Para cebar las líneas de lavado de proteínas y columnas, verifique las jeringas derecha e izquierda en la pestaña de entrega de plomería del valorador y haga clic en cebar una vez. Después de marcar todas las casillas de jeringas como se demostró anteriormente, vaya a la pestaña de flujo de enfriamiento manual para ingresar la configuración requerida.
Para un experimento de curso de tiempo, use el botón de punto simbólico para ingresar los tiempos en milisegundos. A continuación, establezca el tiempo de captura en tres y la espera a que HPLC recoja el tiempo más el tiempo de ejecución más 1,5 minutos. Si se ejecutan experimentos en blanco entre ejecuciones de muestra, haga clic en el cuadro en blanco Ejecutar después de asegurarse de que haya una entrada en el software de adquisición para la ejecución en blanco después de cada ejecución de muestra.
Una vez que la lista de muestra esté lista y se hayan resaltado las entradas apropiadas, inicie la ejecución haciendo clic en reproducir y Fast HDX en el software. Para el procesamiento de datos, abra el menú de archivos del archivo de péptidos asignados espectralmente de los experimentos de mapeo de péptidos y haga clic en abrir en el software DynamX, luego importe los archivos sin procesar al software DynamX. Después de abrir el menú de datos, haga clic en MS Files.
Para crear estados para cada condición de proteína que se está estudiando, haga clic en nuevo estado. Para agregar cada punto de tiempo HDX, haga clic en nueva exposición y, a continuación, haga clic en nuevo raw. Para importar archivos sin procesar, arrastre cada archivo a la posición correcta y haga clic en Aceptar cuando haya terminado.
Después de asignar automáticamente isótopos, seleccione manualmente la asignación isotópica para garantizar una alta calidad de los datos. Exporte los datos del clúster en un archivo csv con el orden de columnas como se describe en el manuscrito. Abra el menú de datos en el software de medición de masa y haga clic en exportar datos de clúster.
Para el análisis de datos, primero cargue los datos agrupados exportados en el software de análisis HDX HDfleX. Para ajustar los datos experimentales de todos los experimentos y estados, seleccione los métodos de corrección de intercambio posterior apropiados para obtener las constantes de velocidad observadas para la reacción HDX. Luego calcule un umbral de significancia global utilizando un método preferido en HDfleX y realice pruebas de significación híbridas para determinar las diferencias significativas entre los estados comparados.
El experimento de mapeo en alfa-sinucleína generó un mapa de cobertura peptídica que cubrió el 100% de la secuencia de proteínas con una redundancia promedio de 3.79. Además, este protocolo permitió la generación de curvas de captación de deuterio para diferentes péptidos de alfa-sinucleína, que luego se expresaron como gráficos corregidos ajustados y de intercambio posterior. Fue evidente que la mayor parte del intercambio de hidrógeno / deuterio en alfa-sinucleína se realizó por un segundo.
La diferencia conformacional entre los estados A y B de alfa-sinucleína también fue evidente a partir de la mayor absorción de deuterio por el estado B tanto a nivel de péptido como de aminoácidos. Para una técnica tan sensible, es importante utilizar pruebas de significación estadística robustas al comparar datos. Aquí, utilizamos nuestro software HDfleX.
