Tutti gli organismi hanno disordine nel loro proteoma, stimato fino al 33% Queste regioni sono osservabili mediante spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio, ma solo nell'intervallo di tempo millisecondo. Il nostro protocollo ti mostrerà come farlo con successo. Questa è una tecnica analitica completamente automatizzata.
Basta impostare tutto, programmare le misurazioni del tempo desiderato, premere vai e vai via. Questa tecnica apre l'entusiasmante opportunità di screening per composti che stabilizzano conferme specifiche di proteine intrinsecamente disordinate come l'alfa-sinucleina. Per iniziare la preparazione del campione per la mappatura dei peptidi, prima prendere una fiala di proteina alfa-sinucleina immagazzinata dal congelatore a meno 80 gradi Celsius.
E una volta scongelato, filtrare usando un filtro a siringa da 0,22 micrometri. Quindi misurare l'assorbanza della soluzione a 218 nanometri per determinare la concentrazione proteica usando la legge di Beer-Lambert e diluire la proteina con tampone di equilibrio a una concentrazione finale di cinque micromolari. Successivamente, per configurare il robot autocampionatore, aggiungere 50 microlitri della soluzione proteica a cinque micromolari a una fiala di recupero totale e posizionare la fiala nella posizione del campione nella camera destra dello scambio idrogeno/deuterio, o HDX, robotica in linea con lo spettrometro di massa.
Quindi mettere un flaconcino di tampone di equilibrio e due flaconcini di tampone di lavaggio di pepsina nelle posizioni del reagente una, quattro e cinque delle camere di sinistra e una fiala del tampone di tempra per posizionare il reagente uno nella camera destra HDX e impostare la temperatura a 20 gradi Celsius utilizzando il regolatore di temperatura Peltier. Quindi aggiungere un numero uguale di flaconcini di recupero totale e di fiale di recupero massimo nelle stesse posizioni di reazione della camera sinistra HDX e della camera destra HDX rispettivamente. Quindi, impostare un elenco di esempio con i metodi LC e MS appropriati nel software di pianificazione e avviare la pianificazione.
Per ottenere la mappa di copertura peptidica finale, curare manualmente le assegnazioni isotopiche nel software di analisi dei dati DynamX HDX. Dopo aver pulito lo strumento prototipo Fast HDX, aprire l'interfaccia utente grafica del software HDX compatibile per inizializzare il sistema. Immettere 20 gradi Celsius e 0,5 gradi Celsius rispettivamente come temperatura della camera del campione e della camera di tempra, quindi fare clic su Imposta per applicare le nuove temperature.
Per pulire e preparare lo strumento, impostare i tubi della centrifuga con acqua di grado LC / MS in tutte le prese, quindi controllare le siringhe sinistra e destra nella scheda di mandata idraulica del titolatore e continuare a fare clic su primo fino a quando tutte le bolle d'aria latenti nei tubi sono scomparse. Per selezionare tutte le caselle per le siringhe, vai prima alla scheda macro e fai clic sulla posizione iniziale delle siringhe calibrate, quindi fai prima clic sul ciclo di carico della siringa di lavaggio, quindi lava tutti i volumi del ciclo di miscelazione. Se c'è una bolla in una siringa tampone, scollegare la siringa e degassandola espellendo verticalmente la bolla.
Prima di ricalibrare in posizione zero, sostituire la siringa. Per configurare lo strumento prototipo Fast HDX per esperimenti HDX, inserire prima il tubo di ingresso di titolazione sinistro nel flaconcino di recupero totale. Per evitare l'oligomerizzazione e l'aggregazione indotte dalla temperatura, posizionare il tubo in un frigorifero da tavolo.
Quindi, aggiungere 50 millilitri di tamponi di equilibrio, etichettatura, tempra e lavaggio della pepsina alle rispettive prese tampone nelle camere destra e sinistra dello strumento, quindi aggiungere 50 millilitri di tampone di lavaggio a colonna all'ingresso di lavaggio della pepsina. Per innescare le linee di lavaggio delle proteine e delle colonne, controllare le siringhe destra e sinistra nella scheda di consegna idraulica del titolatore e fare clic su prime una volta. Dopo aver selezionato tutte le caselle per le siringhe come dimostrato in precedenza, vai alla scheda del flusso di spegnimento manuale per inserire le impostazioni richieste.
Per un esperimento di corso temporale, usa il pulsante punto simbolico per inserire i tempi in millisecondi. Quindi impostare il tempo di trappola su tre e l'attesa per HPLC per intrappolare il tempo più il tempo di esecuzione più 1,5 minuti. Se vengono eseguiti esperimenti vuoti tra le esecuzioni di esempio, fare clic sulla casella Esegui vuoto dopo aver verificato una voce nel software di acquisizione per l'esecuzione vuota dopo ogni esecuzione dell'esempio.
Una volta che l'elenco di esempio è pronto e le voci appropriate sono state evidenziate, avviare l'esecuzione facendo clic su play e Fast HDX nel software. Per l'elaborazione dei dati, aprire il menu file del file di peptidi assegnati spettralmente dagli esperimenti di mappatura dei peptidi e fare clic su Apri nel software DynamX, quindi importare i file raw nel software DynamX. Dopo aver aperto il menu dei dati, fare clic su File MS.
Per creare stati per ogni condizione proteica studiata, fare clic su Nuovo stato. Per aggiungere ogni punto temporale HDX, fare clic su Nuova esposizione, quindi fare clic su Nuovo raw. Per importare i file raw, trascinare ogni file nella posizione corretta e fare clic su OK al termine.
Dopo aver assegnato automaticamente gli isotopi, curare manualmente l'assegnazione isotopica per garantire un'elevata qualità dei dati. Esportare i dati del cluster in file csv con l'ordine delle colonne come descritto nel manoscritto. Aprire il menu dei dati nel software di misurazione della massa e fare clic su Esporta dati cluster.
Per l'analisi dei dati, caricare prima i dati del cluster esportati nel software di analisi HDX HDfleX. Per adattare i dati sperimentali a tutti gli esperimenti e gli stati, selezionare i metodi di correzione dello scambio posteriore appropriati per ottenere le costanti di velocità osservate per la reazione HDX. Quindi calcolare una soglia di significatività globale utilizzando un metodo preferito in HDfleX ed eseguire test di significatività ibridi per determinare le differenze significative tra gli stati confrontati.
L'esperimento di mappatura sull'alfa-sinucleina ha generato una mappa di copertura peptidica che copriva il 100% della sequenza proteica con una ridondanza media di 3,79. Inoltre, questo protocollo ha permesso la generazione di curve di assorbimento del deuterio per diversi peptidi di alfa-sinucleina, che sono stati poi espressi come grafici corretti di scambio adattato e posteriore. Era evidente che la maggior parte dello scambio idrogeno/deuterio nell'alfa-sinucleina è stato fatto di un secondo.
La differenza conformazionale tra gli stati A e B dell'alfa-sinucleina era evidente anche dal più alto assorbimento di deuterio da parte dello stato B sia a livello di peptidi che di amminoacidi. Per una tecnica così sensibile, è importante utilizzare solidi test di significatività statistica quando si confrontano i dati. Qui, abbiamo usato il nostro software HDfleX.
