모든 유기체는 프로테옴에 장애가 있으며, 최대 33 %까지 추정됩니다.이 영역은 수소 / 중수소 교환 질량 분광법에 의해 관찰 가능하지만 밀리 초 시간 범위에서만 관찰 할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은이 작업을 성공적으로 수행하는 방법을 보여줍니다. 이것은 완전히 자동화 된 분석 기술입니다.
모든 것을 설정하고, 원하는 시간 측정을 프로그래밍하고, 가서 떠나십시오. 이 기술은 알파 시누클레인과 같은 본질적으로 무질서한 단백질의 특정 확인을 안정화시키는 화합물을 스크리닝하는 흥미로운 기회를 열어줍니다. 펩티드 매핑을 위한 샘플 준비를 시작하려면, 먼저 영하 80도 냉동고에서 저장된 알파-시누클레인 단백질 스톡의 바이알을 취한다.
그리고 일단 해동되면, 0.22 마이크로미터 시린지 필터를 사용하여 여과한다. 그런 다음 Beer-Lambert의 법칙을 사용하여 단백질 농도를 결정하기 위해 218 나노 미터에서 용액의 흡광도를 측정하고 평형 버퍼로 단백질을 다섯 마이크로 몰의 최종 농도로 희석하십시오. 다음으로, 자동 시료 주입기 로봇을 설정하려면 5 마이크로 몰 단백질 용액 50 마이크로 리터를 총 회수 바이알에 추가하고 질량 분광계에 따라 수소 / 중수소 교환 또는 HDX 로봇 공학의 오른쪽 챔버의 샘플 위치에 바이알을 놓습니다.
그런 다음 평형 버퍼 한 바이알과 펩신 세척 버퍼 두 바이알을 시약 위치에 넣고 좌측 챔버의 하나, 네 개, 다섯 개와 담금질 버퍼의 바이알 하나를 HDX 우측 챔버 내에 시약 위치에 놓고 펠티에 온도 조절기를 사용하여 섭씨 20도로 온도를 설정한다. 그런 다음 동일한 수의 총 회수 바이알 및 최대 회수 바이알을 각각 HDX 좌측 챔버 및 HDX 우측 챔버의 동일한 반응 위치에 첨가한다. 다음으로, 스케줄링 소프트웨어에서 적절한 LC 및 MS 방법을 사용하여 샘플 리스트를 설정하고 스케줄을 시작한다.
최종 펩티드 커버리지 맵을 얻으려면 DynamX HDX 데이터 분석 소프트웨어에서 동위원소 할당을 수동으로 큐레이트하십시오. 고속 HDX 프로토타입 장비를 청소한 후 호환되는 HDX 소프트웨어의 그래픽 사용자 인터페이스를 열어 시스템을 초기화합니다. 샘플 챔버 및 담금질 챔버 온도로 각각 섭씨 20도, 섭씨 0.5도를 입력한 다음 세트를 클릭하여 새 온도를 적용합니다.
장비를 청소하고 준비하려면 모든 입구에 LC/MS 등급의 물로 원심분리 튜브를 설치한 다음 적정기 배관 전달 탭에서 왼쪽 및 오른쪽 주사기를 모두 확인하고 튜브의 모든 잠복 기포가 사라질 때까지 프라임을 계속 클릭합니다. 주사기의 모든 상자를 확인하려면 먼저 매크로 탭으로 이동하여 주사기 홈 위치 보정을 클릭 한 다음 먼저 주사기 로드 루프 세척을 클릭 한 다음 모든 혼합 루프 볼륨을 씻으십시오. 버퍼 주사기에 거품이 있으면 주사기를 분리하고 수직으로 거품을 배출하여 가스를 제거합니다.
제로 위치로 재보정하기 전에 주사기를 교체하십시오. HDX 실험을 위한 Fast HDX 프로토타입 장비를 설정하려면 먼저 왼쪽 적정 유입 튜브를 전체 회수 바이알에 삽입하십시오. 온도로 인한 올리고머화 및 응집을 방지하려면 튜브를 탁상 냉장고에 보관하십시오.
다음으로, 50 밀리리터의 평형, 라벨링, 담금질 및 펩신 세척 버퍼를 기기의 오른쪽 및 왼쪽 챔버의 각 버퍼 입구에 첨가 한 다음 50 밀리리터의 컬럼 세척 버퍼를 펩신 세척 입구에 첨가하십시오. 단백질 및 컬럼 세척 라인을 프라이밍하려면 적정기 배관 전달 탭에서 오른쪽 및 왼쪽 주사기를 확인하고 프라임을 한 번 클릭합니다. 앞에서 설명한 대로 주사기의 모든 상자를 확인한 후 수동 담금질 흐름 탭으로 이동하여 필요한 설정을 입력합니다.
시간 코스 실험의 경우 기호 점 단추를 사용하여 시간을 밀리초 단위로 입력합니다. 그런 다음 트랩 시간을 3으로 설정하고 HPLC가 트랩 시간과 실행 시간을 더한 1.5 분을 기다립니다. 샘플 실행 사이에 빈 실험이 실행되는 경우 각 샘플 실행 후 빈 실행에 대한 획득 소프트웨어에 항목을 확인한 후 빈 실행 상자를 클릭합니다.
샘플 목록이 준비되고 적절한 항목이 강조 표시되면 소프트웨어에서 재생 및 빠른 HDX를 클릭하여 실행을 시작합니다. 데이터 처리를 위해 펩티드 매핑 실험에서 스펙트럼으로 할당된 펩티드 파일의 파일 메뉴를 열고 DynamX 소프트웨어에서 열기를 클릭한 다음 원시 파일을 DynamX 소프트웨어로 가져옵니다. 데이터 메뉴를 연 후 MS 파일을 클릭하십시오.
연구되는 각 단백질 조건에 대한 상태를 만들려면 새 상태를 클릭하십시오. 각 HDX 시점을 추가하려면 새 노출을 클릭한 다음 새 원시를 클릭합니다. 원시 파일을 가져오려면 각 파일을 올바른 위치로 드래그하고 완료되면 확인을 클릭합니다.
동위원소를 자동으로 할당한 후 동위원소 할당을 수동으로 큐레이트하여 높은 데이터 품질을 보장합니다. 원고에 설명된 대로 열 순서를 사용하여 csv 파일에서 클러스터 데이터를 내보냅니다. 질량 측정 소프트웨어에서 데이터 메뉴를 열고 클러스터 데이터 내보내기를 클릭하십시오.
데이터 분석을 위해 먼저 내보낸 클러스터된 데이터를 HDX 분석 소프트웨어 HDfleX에 로드합니다. 모든 실험 및 상태에 대한 실험 데이터를 적합하게하려면 적절한 역 교환 보정 방법을 선택하여 HDX 반응에 대해 관찰 된 속도 상수를 얻으십시오. 그런 다음 HDfleX에서 선호되는 방법을 사용하여 전역 유의 임계값을 계산하고 하이브리드 유의 테스트를 수행하여 비교된 상태 간의 유의한 차이를 확인합니다.
알파-시누클레인에 대한 매핑 실험은 3.79의 평균 중복성으로 단백질 서열의 100%를 커버하는 펩티드 커버리지 맵을 생성하였다. 더욱이, 이 프로토콜은 알파-시누클레인의 상이한 펩티드에 대한 중수소 흡수 곡선의 생성을 가능하게 하였고, 이는 그 후 적합 및 역교환 보정된 그래프로 표현되었다. 알파 시누클레인의 대부분의 수소 / 중수소 교환이 일초에 의해 이루어졌다는 것이 분명했습니다.
알파-시누클레인의 상태 A와 B 사이의 형태적 차이는 또한 펩티드 및 아미노산 수준 둘 다에서 상태 B에 의한 더 높은 중수소 흡수로부터 명백하였다. 이러한 민감한 기술의 경우 데이터를 비교할 때 강력한 통계적 유의성 검정을 사용하는 것이 중요합니다. 여기에서는 소프트웨어 HDfleX를 사용했습니다.
