Все организмы имеют расстройство в своем протеоме, оцениваемое до 33%Эти области наблюдаются с помощью масс-спектрометрии водорода / дейтерия, но только в миллисекундном временном диапазоне. Наш протокол покажет вам, как это сделать успешно. Это полностью автоматизированный аналитический метод.
Вы просто настраиваете все, программируете желаемые измерения времени, нажимаете «иди» и уходите. Этот метод открывает захватывающую возможность скрининга соединений, которые стабилизируют конкретные подтверждения внутренне неупорядоченных белков, таких как альфа-синуклеин. Чтобы начать пробоподготовку к пептидному картированию, сначала возьмите флакон с сохраненным запасом белка альфа-синуклеина из морозильной камеры при минус 80 градусах Цельсия.
И как только он разморозится, фильтруйте с помощью шприцевого фильтра 0,22 микрометра. Затем измеряют поглощение раствора на 218 нанометрах для определения концентрации белка по закону Бира-Ламберта, и разбавляют белок равновесным буфером до конечной концентрации пяти микромоляров. Затем, чтобы настроить робота-автосэмплера, добавьте 50 микролитров из пяти микромолярного белкового раствора в общий флакон восстановления и поместите флакон в положение образца в правой камере водородно-дейтериевого обмена, или HDX, робототехники в соответствии с масс-спектрометром.
Затем поместите один флакон равновесного буфера и два флакона пепсинового промывочного буфера в положения реагентов одну, четыре и пять левых камер и один флакон буфера закалки в положение реагента один в правой камере HDX и установите температуру на уровне 20 градусов Цельсия с помощью регулятора температуры Пельтье. Затем добавьте равное количество флаконов с общим восстановлением и флаконов с максимальным восстановлением в одинаковых реакционных положениях левой камеры HDX и правой камеры HDX соответственно. Затем настройте примерный список с соответствующими методами LC и MS в программном обеспечении планирования и запустите расписание.
Чтобы получить окончательную карту покрытия пептидов, вручную курируйте изотопные назначения в программном обеспечении для анализа данных DynamX HDX. После очистки прототипа fast HDX откройте графический пользовательский интерфейс совместимого программного обеспечения HDX для инициализации системы. Введите 20 градусов цельсия и 0,5 градуса Цельсия в качестве температуры камеры для отбора проб и камеры закалки соответственно, а затем нажмите на набор для применения новых температур.
Чтобы очистить и подготовить инструмент, установите трубки центрифуги с водой класса LC / MS на всех входах, затем проверьте левый и правый шприцы в вкладке подачи сантехники титратора и продолжайте нажимать прайм до тех пор, пока все скрытые пузырьки воздуха в трубках не исчезнут. Чтобы проверить все поля для шприцев, сначала перейдите на вкладку макросов и нажмите на калибровочные шприцы в домашнем положении, затем сначала нажмите петлю загрузки шприца стирки, а затем промыть все объемы смесительного контура. Если в буферном шприце есть пузырь, отсоедините шприц и дегазируйте его, вертикально выталкивая пузырь.
Перед повторной калибровкой в нулевое положение замените шприц. Для настройки прототипа прибора Fast HDX для экспериментов HDX сначала вставьте левую впускную трубку титрования в флакон для полного восстановления. Чтобы предотвратить вызванную температурой олигомеризацию и агрегацию, поместите трубку в настольный холодильник.
Затем добавьте 50 миллилитров буферов равновесия, маркировки, закалки и промывки пепсина в соответствующие буферные входы в правой и левой камерах инструмента, а затем добавьте 50 миллилитров буфера промывки колонны в входное отверстие для промывки пепсина. Для грунтовки линий промывки белка и колонки проверьте правый и левый шприцы на вкладке доставки титраторной сантехники и нажмите «Прайм» один раз. После установки всех флажков для шприцев, как показано ранее, перейдите на вкладку ручной закалки потока, чтобы ввести необходимые настройки.
Для эксперимента с временным курсом используйте символьную точечную кнопку, чтобы ввести время в миллисекундах. Затем установите время ловушки на три и ожидание времени перехвата ВЭЖХ плюс время выполнения плюс 1,5 минуты. Если пустые эксперименты выполняются между запусками образцов, щелкните пустое поле Run после проверки записи в программном обеспечении для сбора данных для пустого запуска после каждого запуска образца.
Как только примерный список будет готов и соответствующие записи будут выделены, начните запуск, щелкнув play и Fast HDX в программном обеспечении. Для обработки данных откройте меню файла спектрально назначенных пептидов из экспериментов по отображению пептидов и нажмите кнопку открыть в программном обеспечении DynamX, затем импортируйте необработанные файлы в программное обеспечение DynamX. После открытия меню данных нажмите на MS Files.
Чтобы создать состояния для каждого изучаемого состояния белка, нажмите на новое состояние. Чтобы добавить каждую точку времени HDX, нажмите на новую экспозицию, затем нажмите «Новая необработанная». Чтобы импортировать необработанные файлы, перетащите каждый файл в нужное место и нажмите кнопку ОК по завершении.
После автоматического назначения изотопов вручную курируйте назначение изотопов, чтобы обеспечить высокое качество данных. Экспортируйте данные кластера в CSV-файл с порядком столбцов, как описано в рукописи. Откройте меню данных в программном обеспечении для измерения массы и нажмите на экспорт данных кластера.
Для анализа данных сначала загрузите экспортированные кластерные данные в программное обеспечение для анализа HDX HDfleX. Чтобы соответствовать экспериментальным данным для всех экспериментов и состояний, выберите соответствующие методы коррекции обратного обмена, чтобы получить наблюдаемые константы скорости для реакции HDX. Затем рассчитайте порог глобальной значимости, используя предпочтительный метод в HDfleX, и выполните тестирование гибридной значимости для определения значительных различий между сравниваемыми состояниями.
Картографический эксперимент на альфа-синуклеине сгенерировал карту пептидного покрытия, которая охватывала 100% последовательности белка со средней избыточностью 3,79. Кроме того, этот протокол позволил генерировать кривые поглощения дейтерия для различных пептидов альфа-синуклеина, которые затем были выражены в виде приталенных и скорректированных графиков обратного обмена. Было очевидно, что большая часть обмена водорода и дейтерия в альфа-синуклеине осуществляется за одну секунду.
Конформационная разница между состояниями А и В альфа-синуклеина также была очевидна из более высокого поглощения дейтерия состоянием В как на пептидном, так и на аминокислотном уровнях. Для такого чувствительного метода важно использовать надежные тесты статистической значимости при сравнении данных. Здесь мы использовали наше программное обеспечение HDfleX.
