Los autores desean agradecer a José Luis Ramos-Balderas por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por la siguiente subvención a PLL del CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P y EO-M recibieron una beca del CONACYT (736162 y 481437, respectivamente). MCM-M recibió una beca del CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Todos los experimentos con animales descritos aquí fueron aprobados por el Comité Interno de Manejo Animal (CICUAL) del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México.
NOTA: En la figura 1 se muestra un diagrama de flujo de todo el protocolo.
1. Alojamiento de ratones
<ol><li>Utilizar grupos de ratones hembra o macho de 8-10 semanas de edad, alojados en instalaciones para animales con temperatura y humedad constantes en ciclos de luz/oscuridad de 12 h, con acceso ad libitum a agua y alimentos. NOTA: Este protocolo utiliza una cepa de ratón reportero IL-9 en el fondo C57BL/6, como se describió anteriormente4; sin embargo, otras cepas reporteras de IL-9 podrían ser utilizadas 6,7,8, así como tinción intracelular de IL-9, con resultados variables9.</li>
</ol>2. Infección de ratones
<ol><li>Afeite la espalda de los ratones desde la mitad del cuerpo hasta cerca de la base de la cola 1 día antes de la infección. El uso de anestésicos no es esencial.</li>
	<li>Inocular subcutáneamente a cada ratón con 200 larvas viables de N. brasiliensis (L3) en 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS)10 en la parte inferior de la espalda, como se describió anteriormente2,11, o inyectar 100 μL de PBS solo como control. Sacrificar a los animales el día 4, el día 7 o el día 10 después de la infección.</li>
</ol>3. Aislamiento de pulmón, intestino delgado, mediastínico y ganglios linfáticos mesentéricos
<ol><li>Eutanasia al ratón por luxación cervical. Coloque el ratón en su espalda y rocíelo con etanol al 70%. Haga una incisión en la línea media con tijeras y abra la piel para exponer las áreas abdominal y torácica. NOTA: El isoflurano puede ser utilizado como un método alternativo de eutanasia12. No se recomiendan las cámaras de dióxido de carbono, ya que elCO2 provoca daño en el tejido pulmonar y hemorragia13.</li>
	<li>Aislamiento de ganglios linfáticos mediastínicos y pulmones<ol><li>Haga una incisión en el esternón y corte en forma de "V" para extraer las costillas y los músculos torácicos. Una vez que la cavidad torácica esté expuesta, ubique los ganglios linfáticos mediastínicos junto al esófago, debajo del corazón (ver Figura suplementaria 1).</li>
		<li>Extraer los ganglios linfáticos mediastínicos y recogerlos en 1 mL de medio R-10 (Tabla 1) en una placa de cultivo de 12 pocillos. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta el procesamiento. NOTA: Las muestras deben protegerse de la luz, para evitar disminuir la señal fluorescente de los ratones reporteros utilizados en estos experimentos.</li>
		<li>Extraer los pulmones y recogerlos en 1 ml de medio R-10 en una placa de cultivo de 12 pocillos por ratón. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta el procesamiento.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de cadenas de ganglios linfáticos mesentéricos e intestino delgado<ol><li>Exponga la cavidad peritoneal y mueva con cuidado el intestino delgado hacia la derecha para exponer la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) a lo largo del colon.</li>
		<li>Con fórceps, retire el MLN, enróllelo suavemente sobre una toalla de papel y retire la grasa.</li>
		<li>Transfiera el MLN a 1 ml de medio R-10 en una placa de cultivo de 12 pocillos. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta el procesamiento.</li>
		<li>Corte el intestino delgado justo debajo del esfínter pilórico y por encima del ciego. Tire del intestino lentamente con la ayuda de fórceps, eliminando el mesenterio adjunto y el tejido graso.</li>
		<li>Coloque el intestino delgado sobre una toalla de papel y humedezca generosamente con PBS. Retire los parches de Peyer del intestino delgado con tijeras. NOTA: Para mantener la viabilidad, retire el tejido graso restante y mantenga el intestino delgado húmedo con PBS durante todo el proceso.</li>
		<li>Corte el intestino delgado longitudinalmente con tijeras y deslice suavemente los fórceps sobre el intestino abierto para eliminar el contenido fecal y el moco.</li>
		<li>Sostenga el intestino delgado con fórceps y lávelo en 5 ml de PBS en hielo sumergiéndolo cuidadosamente varias veces. Repita dos veces.</li>
		<li>Cortar el intestino delgado en trozos cortos (aproximadamente 5 mm) y recogerlos en un tubo cónico de 50 mL con 10 mL de HBSS14 con 2% FBS (Tabla 1). Continúe inmediatamente aislando las células intraepiteliales y de lámina propia.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Preparación de suspensiones unicelulares del intestino delgado, pulmón y ganglios linfáticos
NOTA: Es extremadamente importante procesar un máximo de seis ratones por persona cuando se preparan suspensiones unicelulares del intestino delgado, ya que la viabilidad celular disminuye significativamente con períodos de procesamiento más largos. Este método fue adaptado del modelo5 de ratón de infección por Heligmosomoides polygyrus.
<ol><li>Precaliente la incubadora de agitación, medio R-20, HBSS y HBSS-2 mM EDTA (Tabla 1) a 37 °C.</li>
	<li>Preparar 10 mL de medio de digestión del intestino delgado (Tabla 1) por muestra.</li>
	<li>Agitar vigorosamente con la mano los trozos del intestino del paso 3.3.8.</li>
	<li>Filtre cada muestra a través de una malla de nylon (aproximadamente 10 cm x 10 cm) sobre un embudo de vidrio. Lave la muestra agregando 10 ml de HBSS precalentado sobre la malla y deseche el flujo continuo. Repita una vez más. NOTA: Utilice una malla nueva para cada muestra y reutilícela durante todo el procedimiento.</li>
	<li>Retire la malla del embudo y recoja la muestra de la malla en un tubo cónico de 50 ml con 10 ml de HBSS-2 mM EDTA caliente (paso 4.1). Incubar durante 10 min a 37 °C, con agitación a 200 rpm.</li>
	<li>Vórtice durante 10 s a velocidad máxima (3.200 rpm) y filtre la muestra con la malla sobre un embudo de vidrio, recuperando el flujo en un tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Repita los pasos 4.5 y 4.6 dos veces, recuperando el flujo en el mismo tubo cónico de 50 ml. Las células intraepiteliales se encuentran en esta fracción de 30 ml. Guarde el tejido restante.</li>
	<li>Preparación de suspensión unicelular a partir de células intraepiteliales<ol><li>Centrifugar los 30 ml de suspensión celular, recuperados en el paso 4.7, a 450 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 5 ml de PBS y centrifugar a 450 x g durante 5 min a RT. Desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el pellet celular en 3 mL de RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNasa (Tabla 1). Mantener en hielo, protegido de la luz hasta la mancha celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de suspensión unicelular a partir de células de lámina propia<ol><li>Lave el tejido restante del intestino delgado del paso 4.7 vertiendo más de 10 ml de HBSS caliente a través de la malla sobre el embudo. Repita el lavado. Recoja el tejido de la malla en un tubo cónico de 50 ml con 10 ml de medio de digestión del intestino delgado.</li>
		<li>Incubar durante 30 min a 37 °C, con agitación a 200 rpm. Vórtice a velocidad máxima durante 10 s cada 5 min.</li>
		<li>Agregue 10 ml de tampón FACS-EDTA (Tabla 1) para detener la reacción de digestión y colóquelo en hielo.</li>
		<li>Filtrar cada muestra a través de un filtro celular de 100 μm utilizando una pipeta serológica, recuperando la suspensión en un tubo cónico de 50 mL colocado sobre hielo.</li>
		<li>Centrifugar a 600 x g durante 6 min a 4 °C.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante. Lavar el pellet celular con 5 ml de PBS y centrifugar a 600 x g durante 6 min a 4 °C.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de RPMI 10% FBS-20 μg / ml DNasa. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta la mancha celular.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de suspensión unicelular del pulmón NOTA: Cada pulmón e intestino delgado debe ser procesado en paralelo por dos personas para evitar tiempos de manipulación prolongados, lo que resulta en una baja viabilidad celular.<ol><li>Preparar 4 mL de medio de digestión pulmonar (Tabla 1) por muestra procesada.</li>
		<li>Extraer el medio RPMI del pocillo que contiene los pulmones a partir del paso 3.2.3. Cortar el pulmón en trozos pequeños con tijeras finas.</li>
		<li>Transfiera las piezas pulmonares a un tubo cónico de 15 ml con una espátula. Añadir 4 mL de medio de digestión pulmonar (Tabla 1).</li>
		<li>Incubar durante 30 min a 37 °C, con agitación a 250 rpm. Cuando termine, mantenga en hielo hasta que se procese cada muestra.</li>
		<li>Filtrar cada muestra a través de un filtro celular de 100 μm, colocado en un solo pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos. Disociar el tejido con un émbolo de jeringa.</li>
		<li>Recuperar cada muestra en un tubo cónico de 15 mL, y agregar 4 mL de medio R-2 (Tabla 1). Mantener en hielo mientras se procesan las otras muestras.</li>
		<li>Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de medio R-5 (Tabla 1).</li>
		<li>Durante la centrifugación, preparar 4 mL de solución de gradiente de densidad al 27,5% (Tabla 1) por muestra para enriquecer la fracción de células hematopoyéticas15,16. Esta estrategia para la separación unicelular es más eficiente, rentable y menos tóxica en comparación con otros medios de gradiente de densidad similares17.</li>
		<li>Añadir 4 ml de solución de gradiente de densidad al 27,5% al 1 ml de suspensión celular del paso 4.10.7 y agitar vigorosamente.</li>
		<li>Agregue lentamente 1 ml de medio R-5 (Tabla 1) sobre la suspensión mixta para crear dos fases.</li>
		<li>Centrífuga a 1.500 x g durante 20 min en RT, con baja aceleración y el freno apagado. Observa el anillo formado entre las dos fases.</li>
		<li>Recuperar el anillo formado entre las dos fases con una micropipeta de 1 mL, y resuspender en 4 mL de medio R-2.</li>
		<li>Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en 1 mL de tampón ACK (Tabla 1), e incubar durante 1 min a RT.</li>
		<li>Añadir 4 ml de medio R-5 y centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de medio R-10. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta la tinción para citometría de flujo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de suspensión unicelular a partir de ganglios linfáticos<ol><li>Coloque los ganglios linfáticos de los pasos 3.2.2 o 3.3.3 entre dos piezas de malla en un pocillo de una placa de cultivo de 6 pocillos y disocie con un émbolo de jeringa.</li>
		<li>Recuperar la suspensión celular en un tubo cónico de 1,5 ml y centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de medio R-10. Mantener en hielo, protegido de la luz hasta la tinción para citometría de flujo. NOTA: Si los grupos son visibles, filtre la muestra a través de un filtro de células de 100 μm.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Tinción celular para citometría de flujo (Figura 2 y Figura 3)
NOTA: Centrifugar las suspensiones de células ganglionares a partir del paso 4.11.3 a 450 x g durante 5 min a 4 °C, y resuspender la cápsula celular en 500 μL de tampón FACS (Tabla 1).
<ol><li>Tinción celular para la identificación de ILC2s (Figura 3 y Figura complementaria 2) NOTA: Este procedimiento de tinción es específico para la identificación de células ILC2 que expresan IL-9.<ol><li>Placa de 150 μL por muestra pulmonar (aproximadamente 1,8 x 10 6 células) del paso 4.10.14, y 50 μL por muestra de ganglio linfático del paso 4.11.3 (aproximadamente 0,7 x 10 6 y 2,2 x 106 células para muestras de ganglios linfáticos mediastínicos y mesentéricos, respectivamente) en una placa de cultivo de fondo cónico de 96 pocillos. Añadir 100 μL de tampón FACS y centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Placa de 100 μL por muestra de intestino delgado (aproximadamente 2,7 x 10 6 y 0,6 x 106 células para muestras intraepiteliales y de lámina propia, respectivamente) de los pasos 4.8.3 y 4.9.7 en una placa de cultivo de fondo cónico de 96 pocillos. Añadir 150 μL de tampón FACS y centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y resuspender cada pellet celular en 50 μL del cóctel de anticuerpos biotinilados (Tabla 2) diluido en tampón FACS. Incubar durante 30 min a 4 °C protegido de la luz. NOTA: Utilice tampón FACS con 20 μg/ml de DNasa para muestras intraepiteliales y de lámina propia.</li>
		<li>Añadir 150 μL de tampón FACS. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón FACS. Centrifugar de nuevo y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el pellet celular en 50 μL del cóctel anticuerpo/tinción (Tabla 2) e incubar durante 30 min a 4 °C protegido de la luz.</li>
		<li>Añadir 150 μL de tampón FACS. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 200 μL de tampón FACS. Centrifugar de nuevo y desechar el sobrenadante. Repetir el lavado (paso 5.1.7) y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el pellet celular en 300 μL de tampón FACS, y analizar por citometría de flujo.</li>
		<li>Para las muestras de intestino delgado y pulmón, use la estrategia de compuerta: linfocitos, células individuales, células vivas, células hematopoyéticas, células de linaje CD90+, células ST2+ y células IL-9+ (Figura 3A, B y Figura complementaria 2A). Para las muestras de ganglios linfáticos, utilice la estrategia de compuerta: células vivas, células individuales, células de linaje CD90+, células ST2+ y células IL-9+ (Figura complementaria 2B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción celular para la identificación de linfocitos productores de IL-9 (Figura 2 y Figura complementaria 3)<ol><li>Transfiera 800 μL por muestra pulmonar desde el paso 4.10.14 a un tubo de 1,5 ml (aproximadamente 14,6 x 106 células). Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
		<li>Para muestras de ganglios linfáticos, placa 400 μL de la suspensión celular del paso 4.11.3 (aproximadamente 5,6 x 10 6 y 17,5 x 106 células para muestras de ganglios linfáticos mediastínicos y mesentéricos, respectivamente) en una placa inferior cónica de 96 pocillos en dos pasos.<ol><li>Transfiera primero 200 μL, centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.</li>
			<li>Transfiera otros 200 μL al pozo correspondiente. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.</li>
		</ol></li>
		<li>Resuspender el pellet celular en 50-400 μL del cóctel anticuerpo/tinción (Tabla 3) e incubar durante 30 min a 4 °C protegido de la luz. NOTA: Las muestras de pulmón deben resuspenderse en 400 μL, las muestras de ganglios linfáticos mediastínicos en 50 μL y las muestras de ganglios linfáticos mesentéricos en 100 μL del cóctel de tinción.</li>
		<li>Añadir 150 μL de tampón FACS a las muestras de ganglios linfáticos mediastínicos y 100 μL a las muestras de ganglios linfáticos mesentéricos. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Lave las muestras de pulmón y ganglios linfáticos resuspendiendo los gránulos en 1 ml y 200 μl de tampón FACS, respectivamente. Centrifugar a 450x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y repita el lavado.</li>
		<li>Resuspender las muestras pulmonares en 600 μL de tampón FACS y analizarlas por citometría de flujo. Utilice la estrategia de compuerta: linfocitos, células individuales, células vivas, células hematopoyéticas, células CD4+TCRβ+ y células IL-9+ (Figura 2A).</li>
		<li>Resuspender las muestras de ganglios linfáticos en 300 μL de tampón FACS y analizar por citometría de flujo. Utilice la estrategia de compuerta: linfocitos, células individuales, células vivas, células CD4+ TCRβ+ y células IL-9+ (Figura 2B y Figura complementaria 3A).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Determinación del número absoluto de células en suspensiones unicelulares
<ol><li>Diluir las muestras de los pasos de aislamiento 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 y 4.11.3 con PBS en una proporción de 1:20 (10 μL de muestra + 190 μL de PBS).</li>
	<li>Mezclar 10 μL de cada muestra diluida de la etapa 6.1 con 10 μL de azul de tripano. Cargue 10 μL en un hemocitómetro y cuente las células vivas, considerando cada dilución.</li>
	<li>Obtener el número absoluto de células multiplicando el porcentaje de la población de interés de células vivas determinado por citometría de flujo (células negativas para el colorante de viabilidad) por el número total de células vivas en la suspensión unicelular después del aislamiento, y dividiendo este número por 100 (Figura suplementaria 4, Figura complementaria 5 y Figura complementaria 6). Número absoluto = (Porcentaje de la población de interés de células vivas determinado por citometría de flujo x Número total de células vivas en la suspensión unicelular)/100</li>
</ol>

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasites - Hookworm. , (2022).</li><li>Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+of+Nippostrongylus+brasiliensis+and+Heligmosomoides+polygyrus.">Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Mearns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4-promoted+T+helper+2+responses+enhance+Nippostrongylus+brasiliensis-induced+pulmonary+pathology.">Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology.</a> Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).</li><li>Licona-Limon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+drive+host+immunity+against+gastrointestinal+worm+infection.">Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection.</a> Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).</li><li>Ferrer-Font, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+intestinal+immune+cells+during+helminth+infection.">High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection.</a> Elife. 9, 51678 (2020).</li><li>Kharwadkar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+efficiency+of+multiple+IL9+reporter+alleles+Is+determined+by+cell+lineage.">Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage.</a> Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).</li><li>Wilhelm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+IL-9+fate+reporter+demonstrates+the+induction+of+an+innate+IL-9+response+in+lung+inflammation.">An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).</li><li>Gerlach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH9+cells+that+express+the+transcription+factor+PU.1+drive+T+cell-mediated+colitis+via+IL-9+receptor+signaling+in+intestinal+epithelial+cells.">TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).</li><li>Olson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+IL-2+is+required+for+optimal+type+2+effector+cytokine+production.">Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate-buffered+saline+(PBS).">Phosphate-buffered saline (PBS).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+and+parasitic+inflammation:+Use+of+Nippostrongylus+and+Schistosoma+models.">Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models.</a> Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).</li><li>Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+isoflurane+and+CO2+inhalation+on+plasma+levels+of+inflammatory+markers+associated+with+collagen-induced+arthritis+in+DBA+mice.">Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice.</a> International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+behavioral,+and+histologic+responses+to+various+euthanasia+methods+in+C57BL/6Ntac+male+mice.">Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>old Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hank's+balanced+salt+solution+(HBSS)+without+phenol+red.">Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Bielecki, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-resident+innate+lymphoid+cells+converge+on+a+pathogenic+effector+state.">Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state.</a> Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).</li><li>Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+TGF-beta+and+IL-15+cytokines+control+the+number+of+short-lived+effector+CD8++T+cells.">Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells.</a> Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).</li><li>Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single-cell+encapsulation+efficiency+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspension.">Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension.</a> Micromachines. 11 (1), 94 (2020).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-25-responsive,+lineage-negative+KLRG1(hi)+cells+are+multipotential+'inflammatory'+type+2+innate+lymphoid+cells.">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S1P-dependent+interorgan+trafficking+of+group+2+innate+lymphoid+cells+supports+host+defense.">S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense.</a> Science. 359 (6371), 114-119 (2018).</li><li>Flamar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-33+induces+the+enzyme+Tryptophan+hydroxylase+1+to+promote+inflammatory+group+2+innate+lymphoid+cell-mediated+immunity.">Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity.</a> Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).</li><li>Olgu&#237;n-Mart&#237;nez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-33+and+the+PKA+pathway+regulate+ILC2+populations+expressing+IL-9+and+ST2.">IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2.</a> Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).</li><li>Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+molecular+markers+and+heterogeneity+in+type+2+innate+lymphoid+cells.">Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells.</a> Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).</li><li>Noelle, R. J., Nowark, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+sources+and+immune+functions+of+interleukin-9.">Cellular sources and immune functions of interleukin-9.</a> Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Una comprensión completa de las interacciones parásito-huésped intestinal y las respuestas inmunes a la infección por helmintos requiere la identificación y el análisis de las diferentes poblaciones celulares y moléculas efectoras que son clave para la inducción de la remodelación tisular y la expulsión de gusanos. Las helmintiasis transmitidas por el suelo representan un gran problema en los países en desarrollo de todo el mundo. Sin embargo, hasta hace poco, no se disponía de un protocolo que permitiera el ...

Los anquilostomas son parásitos intestinales que infectan a aproximadamente 700 millones de personas en todo el mundo, principalmente en áreas tropicales de países subdesarrollados. Las infecciones de alta intensidad con Ancylostoma duodenale y Necator americanus, los parásitos anquilostomas más comunes en humanos, causan anemia y deficiencia de proteínas que pueden resultar en retraso en el crecimiento y el desarrollo mental1. N. americanus y el parásito roedor Nippostrongylus brasiliensis inducen una respuesta inmune prototípica tipo 2 en su huésped y comparten similitudes en su ciclo de vida. Por lo tanto, la infección de ratones con N. brasiliensis es el modelo más comúnmente utilizado para las infecciones por anquilostomas humanas. Estadio 3 (L3) Las larvas infecciosas de N. brasiliensis se mueven de la piel al pulmón en las primeras horas después de la infección. Una vez en el pulmón, se convierten en L4 y migran por la tráquea para ser tragados, pasan a través del estómago y llegan al intestino para convertirse en adultos (L5) dentro de 4-5 días. En el intestino, los gusanos L5 ponen huevos que se excretan en las heces para reiniciar el ciclo de vida del parásito2.
La respuesta inmune inducida por N. brasiliensis se caracteriza por un aumento en varias citoquinas tipo 2, incluyendo IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, junto con eosinofilia, basofilia, cáliz e hiperplasia de mastocitos, y una mayor producción de IgG1 e IgE. La mayoría de los estudios que intentan identificar y definir las respuestas inmunes provocadas por la infección por N. brasiliensis se centran en el papel de IL-4 o IL-13 en este modelo3. Sin embargo, la identificación y caracterización de las células que expresan IL-9 y la función de esta citoquina se habían pasado por alto en gran medida, hasta que Licona-Limón et al. publicaron el primer estudio que demuestra un papel crítico para IL-9 en la respuesta inmune contra N. brasiliensis. Utilizando ratones reporteros, este estudio describió las células T (principalmente T helper 9) y las células linfoides innatas tipo 2 (ILC2) como los principales subconjuntos celulares que expresan IL-9 tras la infección4.
El aislamiento y la caracterización de las células inmunes de los pulmones infectados por helmintos es factible, y ha sido ampliamente reportado 3,4. Sin embargo, debido a la remodelación tisular inherente y la producción de moco, hacerlo en el intestino infectado resultó ser un desafío técnico, hasta la reciente publicación de Ferrer-Font et al.5. El grupo describió un protocolo para aislar y analizar suspensiones unicelulares de subconjuntos inmunes de intestinos murinos infectados con Heligmosomoides polygyrus. Basándonos en él, ahora hemos estandarizado un protocolo para el aislamiento y el análisis citométrico de las células linfoides que expresan IL-9 del intestino infectado por N. brasiliensis. Además, hemos establecido la cinética de IL-9 a partir de diferentes fuentes celulares y ubicaciones anatómicas a lo largo de la infección.
La caracterización de las distintas poblaciones celulares involucradas en esta infección es vital para una comprensión más amplia de la respuesta inmune al parásito y su interacción con el huésped. Este protocolo integral proporciona una ruta clara para aislar y analizar las células productoras de IL-9 de los órganos deseados en las etapas de interés de la enfermedad, lo que permite una mejora aguda del conocimiento sobre el papel de estas células en la infección por N. brasiliensis y las infecciones parasitarias en general.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Nxt cytometer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (BV421)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>Specific activity: &#8805;10 000 units/mg&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facs ARIA II sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Melody cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc&#949;RI</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13589885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analysis data software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>305931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>514103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>&#160;&#8206; lba</td>
			<td>B07HYHHX5V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946; (PE/Cy7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#947;&#948;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine buffer&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for the study of il-9-producing lymphoid cells in the nippostrongylus brasiliensis infection model

IL-9 es una citocina pleiotrópica asociada con diversos procesos, incluida la inmunidad antitumoral, la inducción de patologías alérgicas y la respuesta inmune contra las infecciones por helmintos, donde desempeña un papel importante en la expulsión del parásito. En un modelo murino de infección por Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 es producida principalmente por linfocitos T CD4 + y células linfoides innatas que se encuentran en el pulmón, el intestino delgado y los ganglios linfáticos drenantes. Dadas las dificultades técnicas involucradas en la tinción intracelular de IL-9, así como la complejidad de aislar células hematopoyéticas del intestino delgado tras la infección, existe una necesidad apremiante de un protocolo completo pero directo para analizar la expresión de IL-9 en diferentes tejidos linfoides y no linfoides en este modelo. El protocolo descrito aquí describe la cinética de IL-9 producida por las células T CD4 + y las células linfoides innatas en el pulmón y el intestino delgado, los principales órganos dirigidos por N. brasiliensis, así como en los ganglios linfáticos mediastínicos y mesentéricos, a lo largo de la infección. Además, detalla el número de larvas necesarias para la infección, dependiendo del tipo de célula y órgano de interés. Este protocolo tiene como objetivo ayudar en la estandarización de ensayos para ahorrar tiempo y recursos al ofrecer la oportunidad de centrarse en las células, órganos y etapas específicas de la enfermedad de interés en el modelo de infección por N. brasiliensis.

Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 200 larvas de N. brasiliensis en estadio L3, o con PBS para controles simulados. El número de larvas utilizadas en este protocolo se ajustó para aislar células viables de los pulmones, el tejido linfoide y el intestino delgado, a diferencia de informes anteriores donde se utilizaron cargas más altas de gusanos para detectar células en tejidos linfoides y pulmones solo4. Los pulmones, los ganglios linfáticos mediastínicos, los g...

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A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

Las células T e ILC2 que expresan IL-9 se inducen durante la infección por N. brasiliensis , sin embargo, su caracterización se ha pasado por alto en gran medida en el intestino infectado debido a su baja frecuencia y cinética diferencial. Este protocolo describe el aislamiento de estas células de diferentes órganos diana y la confirmación de su identidad mediante citometría de flujo en diferentes etapas de infección.

Una estrategia para el estudio de células linfoides productoras de IL-9 en el modelo de infección por Nippostrongylus brasiliensis

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

This protocol allows for the isolation and characterization of lymphoid cells expressing IL-9 in N.brasiliensis non-lymphoid infected tissues including the infected cut which recently was technically invisible.This protocol also provides an alternative to analyze populations of cells from peripheral tissues previously unappreciated in infection due to the intrinsic difficulties of isolating cells from these anatomical sites.This method allows the study of difficult-to-isolate populations from N.brasiliensis infected cut and could be applied to other helminthic infections, broadening our understanding of hookworm infections in humans.Demonstrating the procedure will be Ofelia Mu

a-strategy-for-study-il-9-producing-lymphoid-cells-nippostrongylus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

1.2K vistas.  Universidad Nacional Autónoma de México. This protocol allows for the isolation and characterization of lymphoid cells expressing IL-9 in N.brasiliensis non-lymphoid infected tissues including the infected cut which recently was technically invisible.This protocol also provides an alternative to analyze populations of cells from peripheral tissues previously unappreciated in infection due to the intrinsic difficulties of isolating cells from these anatomical sites.This method allows the study of difficult-to-isolate populations from...