Yazarlar, José Luis Ramos-Balderas'a teknik desteği için teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma, CONACYT'den (fordecyt-pronace-303027) PLL'ye aşağıdaki hibe ile desteklenmiştir. OM-P ve EO-M, CONACIST'ten (sırasıyla 736162 ve 481437) bir burs aldı. MCM-M, CONACIST'ten burs aldı (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Burada açıklanan tüm hayvan deneyleri, Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi, Hücresel Fizyoloji Enstitüsü'nün Hayvan Kullanımı İç Komitesi (CICUAL) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Tüm protokolün akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Farelerin muhafazası
<ol><li>12 saatlik aydınlık / karanlık döngülerde sabit sıcaklık ve neme sahip hayvan tesislerinde barındırılan, suya ve yiyeceğe libitum erişimi olan 8-10 haftalık, dişi veya erkek fare gruplarını kullanın. NOT: Bu protokol, daha önce açıklandığı gibi C57BL/6 arka planında IL-9 muhabir fare suşu kullanır4; Bununla birlikte, diğer IL-9 muhabir suşları 6,7,8 ve hücre içi IL-9 boyama ile değişken sonuçlar 9 kullanılabilir.</li>
</ol>2. Farelerin enfeksiyonu
<ol><li>Farelerin arkasını vücudun ortasından enfeksiyondan 1 gün önce kuyruğun tabanına yakın bir yere tıraş edin. Anestezik kullanımı gerekli değildir.</li>
	<li>Subkutan olarak her fareyi, daha önce tarif edildiği gibi, alt sırtta 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS)10'da 200 canlı üçüncü aşama N. brasiliensis larvası (L3) ile aşılayın veya kontrol olarak tek başına 100 μL PBS enjekte edin. Hayvanları enfeksiyon sonrası 4. gün, 7. gün veya 10. günde kurban edin.</li>
</ol>3. Akciğer, ince bağırsak, mediastinal ve mezenterik lenf nodlarının izolasyonu
<ol><li>Servikal çıkık ile fareyi ötenazileştirin. Fareyi sırtına yerleştirin ve% 70 etanol püskürtün. Makas kullanarak orta hat kesisi yapın ve karın ve torasik bölgeleri ortaya çıkarmak için cildi açın. NOT: İzofluran alternatif ötanazi yöntemi12 olarak kullanılabilir. CO2 akciğer dokusu hasarına ve kanamaya yol açtığı için karbondioksit odaları önerilmez13.</li>
	<li>Mediastinal lenf nodlarının ve akciğerlerin izolasyonu<ol><li>Sternumda bir kesi yapın ve kaburgaları ve torasik kasları çıkarmak için "V" şeklinde kesin. Torasik kavite açığa çıktıktan sonra, mediastinal lenf düğümlerini yemek borusunun yanında, kalbin altında bulun (bakınız Ek Şekil 1).</li>
		<li>Mediastinal lenf nodlarını çıkarın ve bunları 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamında (Tablo 1) toplayın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun. NOT: Bu deneylerde kullanılan muhabir farelerden gelen floresan sinyalinin azalmasını önlemek için numuneler ışıktan korunmalıdır.</li>
		<li>Akciğerleri çıkarın ve fare başına 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamında toplayın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Mezenterik lenf nodu zincirlerinin ve ince bağırsakların izolasyonu<ol><li>Peritoneal boşluğu açığa çıkarın ve kolon boyunca mezenterik lenf nodu (MLN) zincirini açığa çıkarmak için ince bağırsağı dikkatlice sağa hareket ettirin.</li>
		<li>Forseps kullanarak, MLN'yi çıkarın, bir kağıt havlu üzerinde yavaşça yuvarlayın ve yağı çekin.</li>
		<li>MLN'yi 12 kuyucuklu bir kültür plakasında 1 mL R-10 ortamına aktarın. İşlenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
		<li>İnce bağırsağı pilor sfinkterin hemen altında ve çekumun üstünde kesin. Forseps yardımıyla bağırsağı yavaşça dışarı çekin, bağlı mezenter ve yağ dokusunu çıkarın.</li>
		<li>İnce bağırsağı bir kağıt havluya yerleştirin ve PBS ile cömertçe nemlendirin. Peyer'in yamalarını ince bağırsaktan makasla çıkarın. NOT: Canlılığı korumak için, kalan yağ dokusunu çıkarın ve tüm işlem boyunca PBS ile ince bağırsağı nemli tutun.</li>
		<li>İnce bağırsağı makas kullanarak uzunlamasına kesin ve dışkı içeriğini ve mukusları çıkarmak için forsepsleri açık bağırsak üzerinde yavaşça kaydırın.</li>
		<li>İnce bağırsağı forsepslerle tutun ve birkaç kez dikkatlice batırarak buz üzerinde 5 mL PBS içinde yıkayın. İki kez tekrarlayın.</li>
		<li>İnce bağırsağı kısa parçalara ayırın (yaklaşık 5 mm) ve% 2 FBS ile 10 mL HBSS14 içeren 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın (Tablo 1). Hemen intraepitelyal ve lamina propria hücrelerini izole etmeye devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. İnce bağırsak, akciğer ve lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonların hazırlanması
NOT: İnce bağırsaklardan tek hücreli süspansiyonlar hazırlarken kişi başına maksimum altı farenin işlenmesi son derece önemlidir, çünkü hücre canlılığı daha uzun işlem süreleriyle önemli ölçüde azalır. Bu yöntem Heligmosomoides polygyrus enfeksiyon faresi model5'ten uyarlanmıştır.
<ol><li>Sallanan inkübatör, R-20 ortam, HBSS ve HBSS-2 mM EDTA'yı (Tablo 1) 37 ° C'de önceden ısıtın.</li>
	<li>Örnek başına 10 mL ince bağırsak sindirim ortamı (Tablo 1) hazırlayın.</li>
	<li>Bağırsak parçalarını 3.3.8 adımından elle kuvvetlice sallayın.</li>
	<li>Her numuneyi bir cam huni üzerinde naylon bir ağdan (yaklaşık 10 cm x 10 cm) süzün. Numuneyi, ağın üzerine 10 mL önceden ısıtılmış HBSS ekleyerek yıkayın ve akışı atın. Bir kez daha tekrarlayın. NOT: Her numune için yeni bir ağ kullanın ve prosedür boyunca yeniden kullanın.</li>
	<li>Ağı huniden çıkarın ve numuneyi ağdan 10 mL sıcak HBSS-2 mM EDTA (adım 4.1) ile 50 mL konik bir tüp içinde toplayın. 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin, 200 rpm'de sallayın.</li>
	<li>Maksimum hızda (3.200 rpm) 10 s vorteks yapın ve numuneyi bir cam huni üzerinde ağ ile filtreleyerek akışı 50 mL konik bir tüpte geri kazanın.</li>
	<li>4,5 ve 4,6 numaralı adımları iki kez tekrarlayın ve aynı 50 mL konik tüpteki akışı geri kazanın. İntraepitelyal hücreler bu 30 mL fraksiyonda bulunur. Kalan dokuyu kaydedin.</li>
	<li>İntraepitel hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlığı<ol><li>4.7. adımda geri kazanılan 30 mL'lik hücre süspansiyonunu, oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın.</li>
		<li>RT'de 5 dakika boyunca 5 mL PBS ekleyin ve 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Hücre peletini 3 mL RPMI% 10 FBS-20 μg / mL DNaz içinde yeniden askıya alın (Tablo 1). Hücre lekelenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Lamina propria hücrelerinden tek hücreli süspansiyon hazırlığı<ol><li>Kalan ince bağırsak dokusunu, huni üzerindeki ağdan 10 mL'nin üzerine ılık HBSS dökerek adım 4.7'den yıkayın. Yıkamayı tekrarlayın. Dokuyu ağdan 10 mL ince bağırsak sindirim ortamı ile 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın.</li>
		<li>37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, 200 rpm'de sallayın. Her 5 dakikada bir 10 s maksimum hızda vorteks.</li>
		<li>Sindirim reaksiyonunu durdurmak için 10 mL FACS-EDTA tamponu ekleyin (Tablo 1) ve buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Her numuneyi serolojik bir pipet kullanarak 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün ve süspansiyonu buz üzerine yerleştirilmiş 50 mL'lik konik bir tüpte geri kazanın.</li>
		<li>4 °C'de 6 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süper natantı atın. Hücre peletini 5 mL PBS ile yıkayın ve 4 ° C'de 6 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 1 mL RPMI% 10 FBS-20 μg / mL DNaz içinde yeniden askıya alın. Hücre lekelenene kadar ışıktan korunarak buz üzerinde tutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Akciğerden tek hücreli süspansiyon hazırlığı NOT: Her akciğer ve ince bağırsak, uzun kullanım sürelerinden kaçınmak için iki kişi tarafından paralel olarak işlenmelidir, bu da düşük hücre canlılığına neden olur.<ol><li>İşlenen numune başına 4 mL akciğer sindirim ortamı (Tablo 1) hazırlayın.</li>
		<li>RPMI ortamını akciğerleri içeren kuyudan adım 3.2.3'ten çıkarın. Akciğeri ince makasla küçük parçalara ayırın.</li>
		<li>Akciğer parçalarını spatula ile 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 4 mL akciğer sindirim ortamı ekleyin (Tablo 1).</li>
		<li>37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, 250 rpm'de sallayın. İşiniz bittiğinde, her numune işlenene kadar buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Her numuneyi, 6 delikli bir kültür plakasının tek bir kuyucuğuna yerleştirilmiş 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. Dokuyu bir şırınga pistonu ile ayırın.</li>
		<li>Her numuneyi 15 mL'lik bir konik tüpte geri kazanın ve 4 mL R-2 ortamı ekleyin (Tablo 1). Diğer numuneler işlenirken buz üzerinde tutun.</li>
		<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL R-5 ortamında yeniden askıya alın (Tablo 1).</li>
		<li>Santrifüj yaparken, hematopoetik hücre fraksiyonu 15,16'yı zenginleştirmek için numune başına 4 mL% 27.5 yoğunluk-gradyan çözeltisi (Tablo 1) hazırlayın. Tek hücreli ayırma stratejisi, diğer benzer yoğunluk gradyan ortamlarına kıyasla daha verimli, uygun maliyetli ve daha az toksiktir17.</li>
		<li>Adım 4.10.7'den itibaren 1 mL'lik hücre süspansiyonuna 4 mL% 27.5 yoğunluk gradyanı çözeltisi ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın.</li>
		<li>İki faz oluşturmak için karışık süspansiyonun üzerine yavaşça 1 mL R-5 ortamı (Tablo 1) ekleyin.</li>
		<li>RT'de 20 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj, düşük hızlanma ve fren kapalı. İki faz arasında oluşan halkayı gözlemleyin.</li>
		<li>İki faz arasında oluşan halkayı 1 mL mikropipet ile geri kazanın ve 4 mL R-2 ortamında yeniden askıya alın.</li>
		<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Süper natantı atın. Hücre peletini 1 mL ACK tamponunda (Tablo 1) yeniden askıya alın ve RT'de 1 dakika inkübe edin.</li>
		<li>4 mL R-5 orta ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun, akış sitometrisi için lekelenene kadar ışıktan koruyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyon preparatı<ol><li>Lenf düğümlerini 3.2.2 veya 3.3.3 adımlarından iki ağ parçası arasına 6 delikli bir kültür plakasından bir kuyucuk içine yerleştirin ve bir şırınga pistonu ile ayrışın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir konik tüpte geri kazanın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 1 mL R-10 ortamında yeniden askıya alın. Buz üzerinde tutun, akış sitometrisi için lekelenene kadar ışıktan koruyun. NOT: Kümeler görülebiliyorsa, numuneyi 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Akım sitometrisi için hücre boyama (Şekil 2 ve Şekil 3)
NOT: Lenf nodu hücre süspansiyonlarını 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de 4.11.3 adımından santrifüj edin ve hücre peletini 500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın (Tablo 1).
<ol><li>ILC2'lerin tanımlanması için hücre boyama (Şekil 3 ve Ek Şekil 2) NOT: Bu boyama prosedürü, IL-9 eksprese eden ILC2 hücrelerinin tanımlanması için spesifiktir.<ol><li>Adım 4.10.14'ten akciğer örneği başına plaka 150 μL (yaklaşık 1.8 x 10 6 hücre) ve 4.11.3 adımından itibaren lenf nodu örneği başına 50 μL (sırasıyla mediastinalve mezenterik lenf nodu örnekleri için yaklaşık 0.7 x 10 6 ve 2.2 x 106 hücre) 96 kuyucuklu konik alt kültür plakasında. 100 μL FACS tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>İnce bağırsak numunesi başına plaka 100 μL (intraepitelyal ve lamina propria örnekleri için sırasıyla yaklaşık 2.7 x 10 6 ve 0.6 x 10 6 hücre)96 kuyucuklu bir konik alt kültür plakasında 4.8.3ve 4.9.7 adımlarından. 150 μL FACS tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatanı atın ve her hücre peletini FACS tamponunda seyreltilmiş biyotinile antikor kokteylinin 50 μL'sinde (Tablo 2) yeniden askıya alın. Işıktan korunan 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. NOT: İntraepitelyal ve lamina propria numuneleri için 20 μg/mL DNaz içeren FACS tamponu kullanın.</li>
		<li>150 μL FACS tamponu ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatarı atın.</li>
		<li>Hücre peletini antikor/leke kokteylinin 50 μL'sinde yeniden askıya alın (Tablo 2) ve ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>150 μL FACS tamponu ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj.</li>
		<li>Süper natantı atın ve hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatarı atın. Yıkamayı tekrarlayın (adım 5.1.7) ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücre peletini 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz edin.</li>
		<li>İnce bağırsak ve akciğer örnekleri için geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, hematopoetik hücreler, CD90 + Soy hücreleri, ST2 + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 3A, B ve Ek Şekil 2A). Lenf nodu örnekleri için geçit stratejisini kullanın: canlı hücreler, tek hücreler, CD90 + Soy hücreleri, ST2 + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Ek Şekil 2B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>IL-9 üreten lenfositlerin tanımlanması için hücre boyama (Şekil 2 ve Ek Şekil 3)<ol><li>Akciğer örneği başına 800 μL'yi adım 4.10.14'ten 1.5 mL'lik bir tüpe (yaklaşık 14.6 x 106 hücre) aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Süper natantı atın.</li>
		<li>Lenf nodu örnekleri için, 4.11.3 adımından itibaren hücre süspansiyonunun 400 μL'lik plakası (mediastinal ve mezenterik lenf nodu örnekleri için sırasıyla yaklaşık 5.6 x 10 6ve 17.5 x 106 hücre) iki adımda 96 kuyucuklu konik bir alt plakada.<ol><li>Önce 200 μL aktarın, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
			<li>İlgili kuyuya 200 μL daha aktarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
		</ol></li>
		<li>Hücre peletini antikor/leke kokteylinin 50-400 μL'sinde yeniden askıya alın (Tablo 3) ve ışıktan korunan 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. NOT: Akciğer örnekleri 400 μL'de, mediastinal lenf nodu örnekleri 50 μL'de ve mezenterik lenf nodu örnekleri boyama kokteylinin 100 μL'sinde yeniden askıya alınmalıdır.</li>
		<li>Mediastinal lenf nodu örneklerine 150 μL FACS tamponu ve mezenterik lenf nodu örneklerine 100 μL ekleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Akciğer ve lenf nodu örneklerini, peletleri sırasıyla 1 mL ve 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alarak yıkayın. 4 °C'de 5dakika boyunca 450 x g'de santrifüj. Supernatant'ı atın ve yıkamayı tekrarlayın.</li>
		<li>Akciğer örneklerini 600 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve bunları akış sitometrisi ile analiz edin. Geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, hematopoetik hücreler, CD4 + TCRβ + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 2A).</li>
		<li>Lenf nodu örneklerini 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz edin. Geçit stratejisini kullanın: lenfositler, tek hücreler, canlı hücreler, CD4 + TCRβ + hücreleri ve IL-9 + hücreleri (Şekil 2B ve Ek Şekil 3A).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Tek hücreli süspansiyonlarda mutlak hücre sayısının belirlenmesi
<ol><li>4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 ve 4.11.3 numaralı izolasyon adımlarından alınan numuneleri PBS ile 1:20 oranında (10 μL numune + 190 μL PBS) seyreltin.</li>
	<li>Adım 6.1'den itibaren seyreltilmiş her numunenin 10 μL'sini 10 μL Tripan Mavisi ile karıştırın. Bir hemositometreye 10 μL yükleyin ve her seyreltmeyi göz önünde bulundurarak canlı hücreleri sayın.</li>
	<li>Akış sitometrisi (canlılık boyası negatif hücreleri) ile belirlenen canlı hücrelerden gelen ilgili popülasyonun yüzdesini, izolasyondan sonra tek hücreli süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısıyla çarparak ve bu sayıyı 100'e bölerek mutlak hücre sayılarını elde edin (Ek Şekil 4, Ek Şekil 5 ve Ek Şekil 6). Mutlak sayı = (Akış sitometrisi ile belirlenen canlı hücrelerden gelen ilgi popülasyonunun yüzdesi x Tek hücreli süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısı)/100</li>
</ol>

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasites - Hookworm. , (2022).</li><li>Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+of+Nippostrongylus+brasiliensis+and+Heligmosomoides+polygyrus.">Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Mearns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4-promoted+T+helper+2+responses+enhance+Nippostrongylus+brasiliensis-induced+pulmonary+pathology.">Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology.</a> Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).</li><li>Licona-Limon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+drive+host+immunity+against+gastrointestinal+worm+infection.">Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection.</a> Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).</li><li>Ferrer-Font, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+intestinal+immune+cells+during+helminth+infection.">High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection.</a> Elife. 9, 51678 (2020).</li><li>Kharwadkar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+efficiency+of+multiple+IL9+reporter+alleles+Is+determined+by+cell+lineage.">Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage.</a> Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).</li><li>Wilhelm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+IL-9+fate+reporter+demonstrates+the+induction+of+an+innate+IL-9+response+in+lung+inflammation.">An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).</li><li>Gerlach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH9+cells+that+express+the+transcription+factor+PU.1+drive+T+cell-mediated+colitis+via+IL-9+receptor+signaling+in+intestinal+epithelial+cells.">TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).</li><li>Olson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+IL-2+is+required+for+optimal+type+2+effector+cytokine+production.">Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate-buffered+saline+(PBS).">Phosphate-buffered saline (PBS).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+and+parasitic+inflammation:+Use+of+Nippostrongylus+and+Schistosoma+models.">Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models.</a> Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).</li><li>Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+isoflurane+and+CO2+inhalation+on+plasma+levels+of+inflammatory+markers+associated+with+collagen-induced+arthritis+in+DBA+mice.">Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice.</a> International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+behavioral,+and+histologic+responses+to+various+euthanasia+methods+in+C57BL/6Ntac+male+mice.">Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>old Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hank's+balanced+salt+solution+(HBSS)+without+phenol+red.">Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Bielecki, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-resident+innate+lymphoid+cells+converge+on+a+pathogenic+effector+state.">Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state.</a> Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).</li><li>Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+TGF-beta+and+IL-15+cytokines+control+the+number+of+short-lived+effector+CD8++T+cells.">Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells.</a> Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).</li><li>Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single-cell+encapsulation+efficiency+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspension.">Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension.</a> Micromachines. 11 (1), 94 (2020).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-25-responsive,+lineage-negative+KLRG1(hi)+cells+are+multipotential+'inflammatory'+type+2+innate+lymphoid+cells.">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S1P-dependent+interorgan+trafficking+of+group+2+innate+lymphoid+cells+supports+host+defense.">S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense.</a> Science. 359 (6371), 114-119 (2018).</li><li>Flamar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-33+induces+the+enzyme+Tryptophan+hydroxylase+1+to+promote+inflammatory+group+2+innate+lymphoid+cell-mediated+immunity.">Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity.</a> Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).</li><li>Olgu&#237;n-Mart&#237;nez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-33+and+the+PKA+pathway+regulate+ILC2+populations+expressing+IL-9+and+ST2.">IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2.</a> Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).</li><li>Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+molecular+markers+and+heterogeneity+in+type+2+innate+lymphoid+cells.">Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells.</a> Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).</li><li>Noelle, R. J., Nowark, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+sources+and+immune+functions+of+interleukin-9.">Cellular sources and immune functions of interleukin-9.</a> Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

İntestinal parazit-konakçı etkileşimlerinin ve helmint enfeksiyonuna karşı immün yanıtların tam olarak anlaşılması, doku yeniden şekillenmesi ve solucan kovulmasının indüksiyonu için anahtar olan farklı hücre popülasyonlarının ve efektör moleküllerinin tanımlanmasını ve analiz edilmesini gerektirir. Topraktan bulaşan helmint enfeksiyonları, dünyadaki gelişmekte olan ülkelerde büyük bir sorun teşkil etmektedir. Bununla birlikte, yakın zamana kadar, bu enfeksiyondan etkilenen ana organ o...

Kancalı kurtlar, çoğunlukla az gelişmiş ülkelerdeki tropikal bölgelerde, dünya çapında yaklaşık 700 milyon insanı enfekte eden bağırsak parazitleridir. İnsanlarda en sık görülen kancalı kurt parazitleri olan Ancylostoma duodenale ve Necator americanus ile yüksek yoğunluklu enfeksiyonlar, gecikmiş büyüme ve zihinsel gelişime neden olabilecek anemi ve proteineksikliğine neden olur 1. N. americanus ve kemirgen paraziti Nippostrongylus brasiliensis, konakçılarında prototipik bir tip 2 immün yanıtı indükler ve yaşam döngülerinde benzerlikleri paylaşırlar. Bu nedenle, farelerin N. brasiliensis ile enfeksiyonu, insan kancalı kurt enfeksiyonları için en yaygın kullanılan modeldir. Evre 3 (L3) N. brasiliensis enfektif larvaları, enfeksiyondan sonraki ilk birkaç saat içinde deriden akciğere hareket eder. Akciğere girdikten sonra, L4 olurlar ve yutulmak, mideden geçmek ve 4-5 gün içinde yetişkin olmak için bağırsağa ulaşmak için trakeadan yukarı göç ederler (L5). Bağırsakta, L5 solucanları, parazit yaşam döngüsünü2 yeniden başlatmak için dışkıda atılan yumurtaları bırakır.
N. brasiliensis tarafından indüklenen immün yanıt, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 ve IL-13 dahil olmak üzere çeşitli tip 2 sitokinlerde bir artışın yanı sıra eozinofili, bazofili, kadeh ve mast hücresi hiperplazisi ve artmış IgG1 ve IgE üretimi ile karakterizedir. N. brasiliensis enfeksiyonu üzerine ortaya çıkan immün yanıtları tanımlamaya ve tanımlamaya çalışan çalışmaların çoğu, IL-4 veya IL-13'ün bu model3'teki rolüne odaklanmıştır. Bununla birlikte, IL-9 eksprese eden hücrelerin tanımlanması ve karakterizasyonu ve bu sitokinin işlevi, Licona-Limón ve ark., IL-9'un N. brasiliensis'e karşı bağışıklık tepkisinde kritik bir rol oynadığını gösteren ilk çalışmayı yayınlayana kadar büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Muhabir fareleri kullanan bu çalışma, T hücrelerini (çoğunlukla T yardımcı 9) ve tip 2 doğuştan gelen lenfoid hücreleri (ILC2'ler), enfeksiyon4 üzerine IL-9'u eksprese eden ana hücresel alt kümeler olarak tanımlamıştır.
Helmint ile enfekte akciğerlerden immün hücrelerin izolasyonu ve karakterizasyonu mümkündür ve kapsamlı bir şekilde rapor edilmiştir 3,4. Bununla birlikte, doğal doku yeniden şekillenmesi ve mukus üretimi nedeniyle, Ferrer-Font ve ark.5'in yakın zamanda yayınlanmasına kadar, enfekte bağırsakta bunu yapmanın teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır. Grup, Heligmosomoides poligyrus ile enfekte murin bağırsaklarından immün alt kümelerin tek hücreli süspansiyonlarını izole etmek ve analiz etmek için bir protokol özetledi. Buna dayanarak, şimdi N. brasiliensis ile enfekte olmuş bağırsaktan IL-9 eksprese eden lenfoid hücrelerin izolasyonu ve sitometrik analizi için bir protokol standartlaştırdık. Ek olarak, enfeksiyon boyunca farklı hücresel kaynaklardan ve anatomik konumlardan IL-9 kinetiği oluşturduk.
Bu enfeksiyonda yer alan farklı hücre popülasyonlarını karakterize etmek, parazite karşı bağışıklık tepkisinin ve konakçı ile etkileşiminin daha geniş bir şekilde anlaşılması için hayati öneme sahiptir. Bu kapsamlı protokol, IL-9 üreten hücreleri ilgilenilen hastalık aşamalarında istenen organlardan izole etmek ve analiz etmek için net bir yol sağlar ve bu hücrelerin N. brasiliensis enfeksiyonu ve genel olarak parazit enfeksiyonlarındaki rolü hakkındaki bilgilerin keskin bir şekilde iyileştirilmesini sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Nxt cytometer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (BV421)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>Specific activity: &#8805;10 000 units/mg&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facs ARIA II sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Melody cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc&#949;RI</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13589885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analysis data software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>305931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>514103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>&#160;&#8206; lba</td>
			<td>B07HYHHX5V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946; (PE/Cy7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#947;&#948;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine buffer&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for the study of il-9-producing lymphoid cells in the nippostrongylus brasiliensis infection model

IL-9, antitümör bağışıklığı, alerjik patolojilerin indüklenmesi ve parazitin atılmasında önemli bir rol oynadığı helmint enfeksiyonlarına karşı bağışıklık tepkisi dahil olmak üzere çeşitli süreçlerle ilişkili pleiotropik bir sitokindir. Nippostrongylus brasiliensis enfeksiyonunun murin modelinde, IL-9 esas olarak CD4 + T lenfositleri ve akciğer, ince bağırsak ve drenaj lenf düğümlerinde bulunan doğuştan gelen lenfoid hücreler tarafından üretilir. IL-9'un hücre içi boyanmasında yer alan teknik zorlukların yanı sıra hematopoetik hücrelerin enfeksiyon üzerine ince bağırsaktan izole edilmesinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, bu modelde farklı lenfoid ve lenfoid olmayan dokularda IL-9 ekspresyonunu analiz etmek için kapsamlı ama basit bir protokole acil bir ihtiyaç vardır. Burada tarif edilen protokol, CD4 + T hücreleri tarafından üretilen IL-9'un kinetiğini ve enfeksiyon boyunca N. brasiliensis tarafından hedeflenen ana organlar olan akciğer ve ince bağırsaktaki doğuştan gelen lenfoid hücrelerin, ayrıca mediastinal ve mezenterik lenf düğümlerinin ana hatlarını çizmektedir. Ek olarak, hücre tipine ve ilgilenilen organa bağlı olarak enfeksiyon için gerekli larva sayısını detaylandırır. Bu protokol, N. brasiliensis enfeksiyon modelinde ilgi çekici spesifik hücrelere, organlara ve hastalık aşamalarına odaklanma fırsatı sunarak zamandan ve kaynaklardan tasarruf etmek için tahlillerin standardizasyonuna yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

Farelere deri altından 200 L3 evre N. brasiliensis larvası veya sahte kontroller için PBS enjekte edildi. Bu protokolde kullanılan larva sayısı, canlı hücreleri akciğerlerden, lenfoid dokudan ve ince bağırsaktan izole etmek için ayarlandı, lenfoid dokulardaki ve akciğerlerdeki hücreleri tespit etmek için daha yüksek solucan yüklerinin kullanıldığı önceki raporların aksine, sadece4. Akciğerler, mediastinal lenf nodları, mezenterik lenf nodları ve ince bağırsak,...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model at JoVE.com

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 eksprese eden T ve ILC2 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında indüklenir, ancak düşük frekansları ve diferansiyel kinetik olmaları nedeniyle enfekte bağırsakta karakterizasyonları büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Bu protokol, bu hücrelerin farklı hedef organlardan izole edilmesini ve farklı enfeksiyon aşamalarında akış sitometrisi yoluyla kimliklerinin doğrulanmasını açıklar.

Nippostrongylus brasiliensis Enfeksiyon Modelinde IL-9 Üreten Lenfoid Hücrelerin İncelenmesi İçin Bir Strateji

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

a-strategy-for-study-il-9-producing-lymphoid-cells-nippostrongylus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

1.2K Görüntüleme.  Universidad Nacional Autónoma de México. IL-9 eksprese eden T ve ILC2 hücreleri, N. brasiliensis enfeksiyonu sırasında indüklenir, ancak düşük frekansları ve diferansiyel kinetik olmaları nedeniyle enfekte bağırsakta karakterizasyonları büyük ölçüde göz ardı edilmiştir. Bu protokol, bu hücrelerin farklı hedef organlardan izole edilmesini ve farklı enfeksiyon aşamalarında akış sitometrisi yoluyla kimliklerinin doğrulanmasını açıklar.

Video: A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

Hamsterlar ve Dorsal Skin Kutanöz Leishmaniasis: Antileishmanial Uyuşturucu Tarama için Faydalı Model

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Kullanımı<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bir Model Organizma olarak Eğitim için<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Enfeksiyon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, Candida can overgrow their natural niches resulting in debilitating mucosal infections as well as life-threatening systemic infections, which are a major focus of investigation due to their associated high mortality rates. Animal models of disseminated infection exist for studying disease progression and dissecting the characteristics of Candida pathogenicity. Of these, the Galleria mellonella waxworm infection model provides a cost-effective experimental tool for high-throughput investigations of systemic virulence. Many other bacterial and eukaryotic infectious agents have been effectively studied in G. mellonella to understand pathogenicity, making it a widely accepted model system. Yet, variation in the method used to infect G. mellonella can alter phenotypic outcomes and complicate interpretation of the results. Here, we outline the benefits and drawbacks of the waxworm model to study systemic Candida pathogenesis and detail an approach to improve reproducibility. Our results highlight the range of mortality kinetics in G. mellonella and describe the variables which can modulate these kinetics. Ultimately, this method stands as an ethical, rapid, and cost-effective approach to study virulence in a model of disseminated candidiasis.

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella serves as an invertebrate model for disseminated candidiasis. Here, we detail the infection protocol and provide supporting data for the model&#39;s effectiveness.

Galleria mellonella Waxworm enfeksiyon modeli Dissemine kandidiyazis için

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal host-microbe interactions. It is well established that different commensals exhibit a different potential to stimulate the host intestinal immune system. Such investigations involve vertebrate animals, especially rodents. Since increasing ethical concerns are linked with experiments involving vertebrates, there is a high demand for invertebrate replacements models. 
Here, we provide a Galleria mellonella oral administration model using commensal non-pathogenic bacteria and the possible assessment of the immunogenic potential of commensals on the G. mellonella immune system. We demonstrate that G. mellonella is a useful alternative invertebrate replacement model that allows the analysis of commensals with different immunogenic potential such as Bacteroides vulgatus and Escherichia coli. Interestingly, the bacteria exhibited no killing effect on the larvae, which is similar to mammals. The immune responses of G. mellonella were comparable with vertebrate innate immune responses and involve recognition of the bacteria and production of antimicrobial molecules. We propose that G. mellonella was able to restore previous microbiota balance, which is well known from healthy mammalian individuals. Although providing comparable innate immune responses in both G. mellonella and vertebrates, G. mellonella does not harbor an adaptive immune system. Since the investigated components of the innate immune system are evolutionary conserved, the model allows a prescreening and first analysis of bacterial immunogenic properties.

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Here, we provide a detailed protocol for an oral administration model using Galleria mellonella larvae and how to characterize induced innate immune responses. Using this protocol, researchers without practical experience will be able to use the G. mellonella force-feeding method.

Bir Galleria mellonella Oral yönetim modeli için Study Commensal-Induced doğuştan gelen bağışıklık yanıtı

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Mycobacterium tüberküloz kompleksinin incelenmesi Için bir enfeksiyon modeli olarak ınvertebrate Galleria mellonella kullanımı

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

Hastalık Modellerinde Hematopoetik Hücrelerin İncelemi için Lentiviral CRISPR/Cas9-Aracılı Genom Düzenleme

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...