Die Autoren danken José Luis Ramos-Balderas für seine technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch den folgenden Zuschuss an PLL von CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027) unterstützt. OM-P und EO-M erhielten ein Stipendium von CONACYT (736162 bzw. 481437). MCM-M erhielt ein Stipendium von CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Alle hier beschriebenen Tierversuche wurden vom Internal Committee for Animal Handling (CICUAL) des Instituts für Zellphysiologie der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko genehmigt.
HINWEIS: Ein Flussdiagramm des gesamten Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Unterbringung von Mäusen
<ol><li>Verwenden Sie 8-10 Wochen alte, weibliche oder männliche Gruppen von Mäusen, die in Tiereinrichtungen mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit in 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen untergebracht sind und ad libitum Zugang zu Wasser und Futter haben. HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet einen IL-9-Reportermausstamm im C57BL/6-Hintergrund, wie zuvor beschrieben4; Es konnten jedoch auch andere IL-9-Reporterstämme verwendet werden 6,7,8 sowie intrazelluläre IL-9-Färbungen mit unterschiedlichen Ergebnissen9.</li>
</ol>2. Infektion von Mäusen
<ol><li>Rasieren Sie den Rücken der Mäuse 1 Tag vor der Infektion von der Körpermitte bis in die Nähe des Schwanzansatzes. Die Verwendung von Anästhetika ist nicht unbedingt erforderlich.</li>
	<li>Impfen Sie jede Maus subkutan mit 200 lebensfähigen N. brasiliensis-Larven (L3) im dritten Stadium in 100 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)10 im unteren Rückenbereich, wie zuvor beschrieben2,11, oder injizieren Sie 100 μl PBS allein als Kontrolle. Opfern Sie die Tiere an Tag 4, Tag 7 oder Tag 10 nach der Infektion.</li>
</ol>3. Isolierung von Lungen-, Dünndarm-, mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten
<ol><li>Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation. Legen Sie die Maus auf den Rücken und besprühen Sie sie mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer Schere einen Mittellinienschnitt und öffnen Sie die Haut, um den Bauch- und Brustbereich freizulegen. HINWEIS: Isofluran kann als alternative Euthanasiemethodeverwendet werden 12. Kohlendioxidkammern werden nicht empfohlen, da CO2 zu Schädigungen des Lungengewebes und Blutungen führt13.</li>
	<li>Isolierung von mediastinalen Lymphknoten und Lungen<ol><li>Machen Sie einen Einschnitt am Brustbein und schneiden Sie in eine "V" -Form, um die Rippen und Brustmuskeln zu entfernen. Sobald die Brusthöhle freigelegt ist, lokalisieren Sie die mediastinalen Lymphknoten neben der Speiseröhre unterhalb des Herzens (siehe ergänzende Abbildung 1).</li>
		<li>Extrahieren Sie die mediastinalen Lymphknoten und sammeln Sie sie in 1 ml R-10-Medium (Tabelle 1) in einer 12-Well-Kulturplatte. Bis zur Verarbeitung lichtgeschützt auf Eis aufbewahren. HINWEIS: Die Proben sollten vor Licht geschützt werden, um zu vermeiden, dass das Fluoreszenzsignal der in diesen Experimenten verwendeten Reportermäuse verringert wird.</li>
		<li>Extrahieren Sie die Lunge und sammeln Sie sie in 1 ml R-10-Medium in einer 12-Well-Kulturplatte pro Maus. Bis zur Verarbeitung lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolierung von mesenterialen Lymphknotenketten und Dünndarm<ol><li>Legen Sie die Bauchhöhle frei und bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig nach rechts, um die mesenteriale Lymphknotenkette (MLN) entlang des Dickdarms freizulegen.</li>
		<li>Entfernen Sie die MLN mit einer Pinzette, rollen Sie sie vorsichtig auf ein Papiertuch und ziehen Sie das Fett ab.</li>
		<li>Übertragen Sie die MLN auf 1 ml R-10-Medium in einer 12-Well-Kulturplatte. Bis zur Verarbeitung lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.</li>
		<li>Schneiden Sie den Dünndarm direkt unter dem Pylorusschließmuskel und über dem Blinddarm. Ziehen Sie den Darm langsam mit Hilfe einer Pinzette heraus und entfernen Sie das anhaftende Mesenterium und Fettgewebe.</li>
		<li>Legen Sie den Dünndarm auf ein Papiertuch und befeuchten Sie ihn großzügig mit PBS. Entfernen Sie die Peyer-Flecken mit einer Schere aus dem Dünndarm. HINWEIS: Um die Lebensfähigkeit zu erhalten, entfernen Sie das restliche Fettgewebe und halten Sie den Dünndarm während des gesamten Prozesses mit PBS feucht.</li>
		<li>Schneiden Sie den Dünndarm mit einer Schere in Längsrichtung ab und schieben Sie die Pinzette vorsichtig über den offenen Darm, um den Kotinhalt und den Schleim zu entfernen.</li>
		<li>Halten Sie den Dünndarm mit einer Pinzette fest und waschen Sie ihn in 5 ml PBS auf Eis, indem Sie ihn einige Male vorsichtig untertauchen. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.</li>
		<li>Schneiden Sie den Dünndarm in kurze Stücke (ca. 5 mm) und sammeln Sie sie in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 10 ml HBSS14 mit 2% FBS (Tabelle 1). Isolieren Sie sofort intraepitheliale und Lamina propria-Zellen.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Dünndarm, Lunge und Lymphknoten
HINWEIS: Bei der Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus dem Dünndarm ist es äußerst wichtig, maximal sechs Mäuse pro Person zu verarbeiten, da die Zelllebensfähigkeit mit längeren Verarbeitungszeiten signifikant abnimmt. Diese Methode wurde aus dem Heligmosomoides polygyrus infection mouse model5 adaptiert.
<ol><li>Der Schüttelinkubator, R-20-Medium, HBSS und HBSS-2 mM EDTA (Tabelle 1) werden bei 37 °C vorgewärmt.</li>
	<li>Bereiten Sie 10 ml Dünndarmverdauungsmedium (Tabelle 1) pro Probe vor.</li>
	<li>Schütteln Sie die Darmstücke aus Schritt 3.3.8 kräftig von Hand.</li>
	<li>Filtern Sie jede Probe durch ein Nylonnetz (ca. 10 cm x 10 cm) über einen Glastrichter. Waschen Sie die Probe, indem Sie 10 ml vorgewärmtes HBSS über das Netz geben und den Durchfluss verwerfen. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal. HINWEIS: Verwenden Sie für jede Probe ein neues Netz und verwenden Sie es während des gesamten Verfahrens wieder.</li>
	<li>Entfernen Sie das Netz aus dem Trichter und entnehmen Sie die Probe aus dem Netz in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 10 ml warmem HBSS-2 mM EDTA (Schritt 4.1). 10 min bei 37 °C inkubieren, bei 200 U/min schütteln.</li>
	<li>Wirbeln Sie 10 s lang bei maximaler Geschwindigkeit (3.200 U/min) und filtrieren Sie die Probe mit dem Netz über einen Glastrichter, wobei der Durchfluss in einem konischen 50-ml-Röhrchen zurückgewonnen wird.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 zweimal, wobei der Durchfluss im selben konischen 50-ml-Röhrchen wiederhergestellt wird. Die intraepithelialen Zellen befinden sich in dieser 30-ml-Fraktion. Bewahren Sie das restliche Gewebe auf.</li>
	<li>Einzelzell-Suspensionspräparat aus intraepithelialen Zellen<ol><li>Zentrifugieren Sie die 30 ml Zellsuspension, die in Schritt 4.7 gewonnen wurde, bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>5 ml PBS zugeben und bei 450 x g 5 min bei RT zentrifugieren.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 3 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase (Tabelle 1). Auf Eis aufbewahren, vor Licht geschützt, bis sich die Zellen verfärben.</li>
	</ol></li>
	<li>Einzellige Suspensionszubereitung aus Lamina-propria-Zellen<ol><li>Waschen Sie das restliche Dünndarmgewebe aus Schritt 4.7, indem Sie über 10 ml warmes HBSS durch das Netz über den Trichter gießen. Wiederholen Sie den Waschvorgang. Sammeln Sie das Gewebe aus dem Netz in einem konischen 50-ml-Röhrchen mit 10 ml Dünndarm-Verdauungsmedium.</li>
		<li>30 min bei 37 °C inkubieren, bei 200 U/min schütteln. Wirbel mit maximaler Geschwindigkeit für 10 s alle 5 Minuten.</li>
		<li>Fügen Sie 10 ml FACS-EDTA-Puffer (Tabelle 1) hinzu, um die Verdauungsreaktion zu stoppen, und legen Sie ihn auf Eis.</li>
		<li>Jede Probe wird mit einer serologischen Pipette durch ein 100-μm-Zellsieb filtriert, wobei die Suspension in einem konischen 50-ml-Röhrchen auf Eis zurückgewonnen wird.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 6 min bei 4 °C.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand. Das Zellpellet wird mit 5 ml PBS gewaschen und bei 600 x g 6 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml RPMI 10% FBS-20 μg/ml DNase. Auf Eis aufbewahren, vor Licht geschützt, bis sich die Zellen verfärben.</li>
	</ol></li>
	<li>Einzelzell-Suspensionspräparat aus der Lunge HINWEIS: Jede Lunge und jeder Dünndarm sollten parallel von zwei Personen bearbeitet werden, um längere Bearbeitungszeiten zu vermeiden, die zu einer geringen Zelllebensfähigkeit führen.<ol><li>Bereiten Sie 4 ml Lungenverdauungsmedium (Tabelle 1) pro verarbeiteter Probe vor.</li>
		<li>Entfernen Sie das RPMI-Medium aus der Vertiefung, die die Lunge aus Schritt 3.2.3 enthält. Schneiden Sie die Lunge mit einer feinen Schere in kleine Stücke.</li>
		<li>Übertragen Sie die Lungenstücke mit einem Spatel in ein konisches 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 4 ml Lungenverdauungsmedium hinzu (Tabelle 1).</li>
		<li>30 min bei 37 °C inkubieren, bei 250 U/min schütteln. Wenn Sie fertig sind, halten Sie es auf Eis, bis jede Probe verarbeitet ist.</li>
		<li>Filtern Sie jede Probe durch ein 100-μm-Zellsieb, das in einer einzigen Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte positioniert ist. Dissoziieren Sie das Gewebe mit einem Spritzenkolben.</li>
		<li>Jede Probe wird in einem konischen 15-ml-Röhrchen entnommen und 4 ml R-2-Medium hinzugefügt (Tabelle 1). Bleiben Sie auf Eis, während die anderen Proben verarbeitet werden.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 600 x g für 5 min bei 4 °C. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 1 ml R-5-Medium resuspendiert (Tabelle 1).</li>
		<li>Während des Zentrifugierens werden 4 ml 27,5%ige Dichtegradientenlösung (Tabelle 1) pro Probe hergestellt, um die hämatopoetische Zellfraktion15,16 anzureichern. Diese Strategie zur Einzelzelltrennung ist im Vergleich zu anderen ähnlichen Dichtegradientenmedien effizienter, kostengünstiger und weniger toxisch17.</li>
		<li>Zu der 1 ml Zellsuspension aus Schritt 4.10.7 werden 4 ml 27,5%ige Dichtegradientenlösung gegeben und kräftig geschüttelt.</li>
		<li>Fügen Sie langsam 1 ml R-5-Medium (Tabelle 1) auf die gemischte Suspension hinzu, um zwei Phasen zu erzeugen.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 1.500 x g für 20 min bei RT, mit geringer Beschleunigung und ausgeschalteter Bremse. Beobachten Sie den Ring, der sich zwischen den beiden Phasen gebildet hat.</li>
		<li>Der zwischen den beiden Phasen gebildete Ring wird mit einer 1-ml-Mikropipette zurückgewonnen und in 4 ml R-2-Medium resuspendiert.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml ACK-Puffer (Tabelle 1) und inkubieren Sie es 1 Minute lang bei RT.</li>
		<li>4 ml R-5-Medium zugeben und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml R-10-Medium. Bis zur Färbung für die Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren.</li>
	</ol></li>
	<li>Einzelzell-Suspensionspräparat aus Lymphknoten<ol><li>Platzieren Sie die Lymphknoten aus den Schritten 3.2.2 oder 3.3.3 zwischen zwei Netzstücken in einer Vertiefung aus einer 6-Well-Kulturplatte und dissoziieren Sie sie mit einem Spritzenkolben.</li>
		<li>Die Zellsuspension wird in einem konischen 1,5-ml-Röhrchen gewonnen und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert.</li>
		<li>Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml R-10-Medium. Bis zur Färbung für die Durchflusszytometrie lichtgeschützt auf Eis aufbewahren. HINWEIS: Wenn Klumpen sichtbar sind, filtern Sie die Probe durch ein 100-μm-Zellsieb.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Zellfärbung für die Durchflusszytometrie (Abbildung 2 und Abbildung 3)
ANMERKUNG: Zentrifugieren Sie die Lymphknotenzellsuspensionen aus Schritt 4.11.3 bei 450 x g für 5 min bei 4 °C und resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl FACS-Puffer (Tabelle 1).
<ol><li>Zellfärbung zur Identifizierung von ILC2s (Abbildung 3 und ergänzende Abbildung 2) HINWEIS: Dieses Färbeverfahren ist spezifisch für die Identifizierung von IL-9-exprimierenden ILC2-Zellen.<ol><li>Platte 150 μl pro Lungenprobe (ca. 1,8 x 10 6 Zellen) aus Schritt 4.10.14 und 50 μl pro Lymphknotenprobe aus Schritt 4.11.3 (ca. 0,7 x 10 6 bzw. 2,2 x 106 Zellen für mediastinale bzw. mesenteriale Lymphknotenproben) in einer konischen 96-Well-Bodenkulturplatte. 100 μl FACS-Puffer zugeben und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Platte 100 μl pro Dünndarmprobe (ca. 2,7 x 10 6 bzw. 0,6 x 106 Zellen für intraepitheliale bzw. Lamina propria-Proben) aus den Schritten 4.8.3 und 4.9.7 in einer konischen 96-Well-Bodenkulturplatte. 150 μl FACS-Puffer zugeben und bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.</li>
		<li>Der Überstand wird verworfen und jedes Zellpellet in 50 μl des biotinylierten Antikörpercocktails (Tabelle 2), verdünnt in FACS-Puffer, resuspendiert. 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren. HINWEIS: Verwenden Sie FACS-Puffer mit 20 μg/ml DNase für intraepitheliale und Lamina-propria-Proben.</li>
		<li>Fügen Sie 150 μl FACS-Puffer hinzu. Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
		<li>Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert. Erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
		<li>Das Zellpellet wird in 50 μl des Antikörper-Färbungs-Cocktails (Tabelle 2) resuspendiert und 30 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubiert.</li>
		<li>Fügen Sie 150 μl FACS-Puffer hinzu. Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
		<li>Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in 200 μl FACS-Puffer resuspendiert. Erneut zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie den Waschvorgang (Schritt 5.1.7) und entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 300 μl FACS-Puffer und analysieren Sie es mittels Durchflusszytometrie.</li>
		<li>Verwenden Sie für die Dünndarm- und Lungenproben die Gating-Strategie: Lymphozyten, Einzelzellen, lebende Zellen, hämatopoetische Zellen, CD90+Lineage-Zellen, ST2+-Zellen und IL-9+-Zellen (Abbildung 3A, B und ergänzende Abbildung 2A). Verwenden Sie für die Lymphknotenproben die Gating-Strategie: lebende Zellen, Einzelzellen, CD90+-Linienzellen, ST2+-Zellen und IL-9+-Zellen (ergänzende Abbildung 2B, C).</li>
	</ol></li>
	<li>Zellfärbung zur Identifizierung von IL-9-produzierenden Lymphozyten (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 3)<ol><li>Transfer von 800 μl pro Lungenprobe aus Schritt 4.10.14 in ein 1,5-ml-Röhrchen (ca. 14,6 x 106 Zellen). Zentrifugieren bei 450 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.</li>
		<li>Für Lymphknotenproben werden 400 μl der Zellsuspension aus Schritt 4.11.3 (ca. 5,6 x 10 6 bzw. 17,5 x 106 Zellen für mediastinale bzw. mesenteriale Lymphknotenproben) in zwei Schritten in eine konische Bodenplatte mit 96 Vertiefungen gegeben.<ol><li>Zuerst 200 μl umfüllen, bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
			<li>Weitere 200 μl in die entsprechende Vertiefung geben. Bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
		</ol></li>
		<li>Das Zellpellet wird in 50-400 μl des Antikörper-Färbe-Cocktails resuspendiert (Tabelle 3) und 30 Minuten bei 4 °C lichtgeschützt inkubiert. HINWEIS: Lungenproben sollten in 400 μl, mediastinale Lymphknotenproben in 50 μl und mesenteriale Lymphknotenproben in 100 μl des Färbecocktails resuspendiert werden.</li>
		<li>Fügen Sie 150 μl FACS-Puffer zu den mediastinalen Lymphknotenproben und 100 μl zu den mesenterialen Lymphknotenproben hinzu. Bei 450 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand verwerfen.</li>
		<li>Waschen Sie die Lungen- und Lymphknotenproben, indem Sie die Pellets in 1 ml bzw. 200 μl FACS-Puffer resuspendieren. Zentrifugieren bei 450 xg für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Lungenproben in 600 μl FACS-Puffer und analysieren Sie sie mittels Durchflusszytometrie. Verwenden Sie die Gating-Strategie: Lymphozyten, Einzelzellen, lebende Zellen, hämatopoetische Zellen, CD4+TCRβ+-Zellen und IL-9+-Zellen (Abbildung 2A).</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Lymphknotenproben in 300 μl FACS-Puffer und analysieren Sie sie mittels Durchflusszytometrie. Verwenden Sie die Gating-Strategie: Lymphozyten, Einzelzellen, lebende Zellen, CD4+ TCRβ+-Zellen und IL-9+-Zellen (Abbildung 2B und ergänzende Abbildung 3A).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Bestimmung der absoluten Anzahl von Zellen in Einzelzellsuspensionen
<ol><li>Die Proben aus den Isolierschritten 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 und 4.11.3 werden mit PBS im Verhältnis 1:20 verdünnt (10 μl Probe + 190 μl PBS).</li>
	<li>Mischen Sie 10 μl jeder verdünnten Probe aus Schritt 6.1 mit 10 μl Trypanblau. Laden Sie 10 μl in ein Hämozytometer und zählen Sie die lebenden Zellen unter Berücksichtigung jeder Verdünnung.</li>
	<li>Man erhält die absolute Anzahl der Zellen, indem man den Prozentsatz der interessierenden Population lebender Zellen, der durch Durchflusszytometrie bestimmt wird (Viabilitätsfarbstoff-negative Zellen), mit der Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Einzelzellsuspension nach der Isolierung multipliziert und diese Zahl durch 100 dividiert (Ergänzende Abbildung 4, Ergänzende Abbildung 5 und Ergänzende Abbildung 6). Absolute Zahl = (Prozentsatz der interessierenden Population aus lebenden Zellen, bestimmt durch Durchflusszytometrie x Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Einzelzellsuspension)/100</li>
</ol>

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasites - Hookworm. , (2022).</li><li>Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+of+Nippostrongylus+brasiliensis+and+Heligmosomoides+polygyrus.">Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Mearns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4-promoted+T+helper+2+responses+enhance+Nippostrongylus+brasiliensis-induced+pulmonary+pathology.">Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology.</a> Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).</li><li>Licona-Limon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+drive+host+immunity+against+gastrointestinal+worm+infection.">Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection.</a> Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).</li><li>Ferrer-Font, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+intestinal+immune+cells+during+helminth+infection.">High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection.</a> Elife. 9, 51678 (2020).</li><li>Kharwadkar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+efficiency+of+multiple+IL9+reporter+alleles+Is+determined+by+cell+lineage.">Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage.</a> Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).</li><li>Wilhelm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+IL-9+fate+reporter+demonstrates+the+induction+of+an+innate+IL-9+response+in+lung+inflammation.">An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).</li><li>Gerlach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH9+cells+that+express+the+transcription+factor+PU.1+drive+T+cell-mediated+colitis+via+IL-9+receptor+signaling+in+intestinal+epithelial+cells.">TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).</li><li>Olson, M. 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M., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+TGF-beta+and+IL-15+cytokines+control+the+number+of+short-lived+effector+CD8++T+cells.">Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells.</a> Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).</li><li>Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single-cell+encapsulation+efficiency+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspension.">Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension.</a> Micromachines. 11 (1), 94 (2020).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-25-responsive,+lineage-negative+KLRG1(hi)+cells+are+multipotential+'inflammatory'+type+2+innate+lymphoid+cells.">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S1P-dependent+interorgan+trafficking+of+group+2+innate+lymphoid+cells+supports+host+defense.">S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense.</a> Science. 359 (6371), 114-119 (2018).</li><li>Flamar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-33+induces+the+enzyme+Tryptophan+hydroxylase+1+to+promote+inflammatory+group+2+innate+lymphoid+cell-mediated+immunity.">Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity.</a> Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).</li><li>Olgu&#237;n-Mart&#237;nez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-33+and+the+PKA+pathway+regulate+ILC2+populations+expressing+IL-9+and+ST2.">IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2.</a> Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).</li><li>Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+molecular+markers+and+heterogeneity+in+type+2+innate+lymphoid+cells.">Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells.</a> Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).</li><li>Noelle, R. J., Nowark, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+sources+and+immune+functions+of+interleukin-9.">Cellular sources and immune functions of interleukin-9.</a> Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Ein vollständiges Verständnis der intestinalen Parasiten-Wirt-Interaktionen und Immunantworten auf Helmintheninfektionen erfordert die Identifizierung und Analyse der verschiedenen Zellpopulationen und Effektormoleküle, die für die Induktion des Gewebeumbaus und der Wurmvertreibung entscheidend sind. Bodenübertragene Helmintheninfektionen stellen in Entwicklungsländern auf der ganzen Welt ein großes Problem dar. Bis vor kurzem war jedoch kein Protokoll verfügbar, das die Analyse seltener Zellpopulationen im Dünn...

Hakenwürmer sind Darmparasiten, die weltweit etwa 700 Millionen Menschen infizieren, meist in tropischen Gebieten in unterentwickelten Ländern. Hochintensive Infektionen mit Ancylostoma duodenale und Necator americanus, den häufigsten Hakenwurmparasiten beim Menschen, verursachen Anämie und Proteinmangel, die zu verzögertem Wachstum und geistiger Entwicklung führen können1. N. americanus und der Nagetierparasit Nippostrongylus brasiliensis induzieren in ihrem Wirt eine prototypische Typ-2-Immunantwort und weisen Ähnlichkeiten in ihrem Lebenszyklus auf. Daher ist die Infektion von Mäusen mit N. brasiliensis das am häufigsten verwendete Modell für menschliche Hakenwurminfektionen. Stadium 3 (L3) infektiöse Larven von N. brasiliensis wandern in den ersten Stunden nach der Infektion von der Haut in die Lunge. Sobald sie in der Lunge sind, werden sie zu L4 und wandern die Luftröhre hinauf, um verschluckt zu werden, den Magen zu passieren und den Darm zu erreichen, um innerhalb von 4-5 Tagen erwachsen zu werden (L5). Im Darm legen L5-Würmer Eier, die mit dem Kot ausgeschieden werden, um den Lebenszyklus des Parasiten neu zu starten2.
Die durch N. brasiliensis induzierte Immunantwort ist gekennzeichnet durch einen Anstieg mehrerer Typ-2-Zytokine, darunter IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 und IL-13, zusammen mit Eosinophilie, Basophilie, Becher- und Mastzellhyperplasie und erhöhter IgG1- und IgE-Produktion. Die meisten Studien, die versuchen, die Immunantworten zu identifizieren und zu definieren, die bei einer Infektion mit N. brasiliensis ausgelöst werden, konzentrieren sich auf die Rolle von IL-4 oder IL-13 in diesem Modell3. Die Identifizierung und Charakterisierung von IL-9-exprimierenden Zellen und die Funktion dieses Zytokins wurden jedoch weitgehend übersehen, bis Licona-Limón et al. die erste Studie veröffentlichten, die eine entscheidende Rolle von IL-9 bei der Immunantwort gegen N. brasiliensis zeigte. Unter Verwendung von Reportermäusen wurden in dieser Studie T-Zellen (meist T-Helfer 9) und angeborene lymphatische Typ-2-Zellen (ILC2s) als die wichtigsten zellulären Untergruppen beschrieben, die IL-9 bei einer Infektion exprimieren4.
Die Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen aus Helminthen-infizierten Lungen ist machbar und wurde ausführlich beschrieben 3,4. Aufgrund des inhärenten Gewebeumbaus und der Schleimproduktion erwies sich dies im infizierten Darm jedoch als technische Herausforderung, bis zur jüngsten Veröffentlichung von Ferrer-Font et al.5. Die Gruppe skizzierte ein Protokoll zur Isolierung und Analyse von Einzelzellsuspensionen von Immununtergruppen aus Heligmosomoides polygyrus-infizierten murinen Därmen. Darauf aufbauend haben wir nun ein Protokoll zur Isolierung und zytometrischen Analyse von IL-9-exprimierenden lymphatischen Zellen aus dem mit N. brasiliensis infizierten Darm standardisiert. Darüber hinaus haben wir die IL-9-Kinetik aus verschiedenen zellulären Quellen und anatomischen Lokalisationen während der gesamten Infektion festgestellt.
Die Charakterisierung der verschiedenen Zellpopulationen, die an dieser Infektion beteiligt sind, ist entscheidend für ein breiteres Verständnis der Immunantwort auf den Parasiten und seiner Interaktion mit dem Wirt. Dieses umfassende Protokoll bietet einen klaren Weg zur Isolierung und Analyse von IL-9-produzierenden Zellen aus gewünschten Organen in interessierenden Krankheitsstadien, was eine deutliche Verbesserung des Wissens über die Rolle dieser Zellen bei N. brasiliensis-Infektionen und Parasiteninfektionen im Allgemeinen ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Nxt cytometer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (BV421)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>Specific activity: &#8805;10 000 units/mg&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facs ARIA II sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Melody cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc&#949;RI</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13589885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analysis data software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>305931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>514103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>&#160;&#8206; lba</td>
			<td>B07HYHHX5V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946; (PE/Cy7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#947;&#948;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine buffer&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for the study of il-9-producing lymphoid cells in the nippostrongylus brasiliensis infection model

IL-9 ist ein pleiotropes Zytokin, das mit verschiedenen Prozessen assoziiert ist, einschließlich der Antitumorimmunität, der Induktion allergischer Pathologien und der Immunantwort gegen Helmintheninfektionen, wo es eine wichtige Rolle bei der Vertreibung des Parasiten spielt. In einem murinen Modell der Nippostrongylus brasiliensis-Infektion wird IL-9 hauptsächlich von CD4+ T-Lymphozyten und angeborenen lymphatischen Zellen produziert, die in der Lunge, im Dünndarm und in drainierenden Lymphknoten vorkommen. Angesichts der technischen Schwierigkeiten, die mit der intrazellulären Färbung von IL-9 verbunden sind, sowie der Komplexität der Isolierung hämatopoetischer Zellen aus dem Dünndarm nach einer Infektion besteht ein dringender Bedarf an einem umfassenden, aber unkomplizierten Protokoll zur Analyse der Expression von IL-9 in verschiedenen lymphatischen und nicht-lymphatischen Geweben in diesem Modell. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die Kinetik von IL-9, die von CD4+ T-Zellen und angeborenen lymphatischen Zellen in der Lunge und im Dünndarm, den Hauptorganen, auf die N. brasiliensis abzielt, sowie in den mediastinalen und mesenterialen Lymphknoten während der gesamten Infektion produziert wird. Darüber hinaus gibt es die Anzahl der Larven an, die für die Infektion benötigt werden, abhängig vom Zelltyp und dem interessierenden Organ. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Standardisierung von Assays zu unterstützen, um Zeit und Ressourcen zu sparen, indem es die Möglichkeit bietet, sich auf die spezifischen Zellen, Organe und Krankheitsstadien zu konzentrieren, die im N. brasiliensis-Infektionsmodell von Interesse sind.

Mäusen wurden subkutan 200 L3-Larven im Stadium N. brasiliensis oder PBS zur Scheinkontrolle injiziert. Die Anzahl der Larven, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurde angepasst, um lebensfähige Zellen aus der Lunge, dem lymphatischen Gewebe und dem Dünndarm zu isolieren, im Gegensatz zu früheren Berichten, in denen nur höhere Würmer zum Nachweis von Zellen in lymphatischen Geweben und Lungen verwendet wurden4. Lunge, mediastinale Lymphknoten, mesenteriale Lymphknoten und der...

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A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-exprimierende T- und ILC2-Zellen werden während einer N. brasiliensis-Infektion induziert, ihre Charakterisierung wurde jedoch im infizierten Darm aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und differentiellen Kinetik weitgehend übersehen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung dieser Zellen aus verschiedenen Zielorganen und die Bestätigung ihrer Identität mittels Durchflusszytometrie in verschiedenen Infektionsstadien.

Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

a-strategy-for-study-il-9-producing-lymphoid-cells-nippostrongylus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

1.2K Aufrufe.  Universidad Nacional Autónoma de México. IL-9-exprimierende T- und ILC2-Zellen werden während einer N. brasiliensis-Infektion induziert, ihre Charakterisierung wurde jedoch im infizierten Darm aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und differentiellen Kinetik weitgehend übersehen. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung dieser Zellen aus verschiedenen Zielorganen und die Bestätigung ihrer Identität mittels Durchflusszytometrie in verschiedenen Infektionsstadien.

Serie: A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Nach Cell-Schicksal<em&gt; E. coli</em&gt; Nach Infektion mit Phagen

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Cutaneous Leishmaniasis in the Dorsal Skin of Hamsters: a Useful Model for the Screening of Antileishmanial Drugs

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of lesion size is a hard procedure and animals show difficulty to eat, breathe and move because of the lesion. In order to optimize the hamster model for cutaneous leishmaniasis, young adult male and female golden hamsters (Mesocricetus auratus) were injected intradermally at the dorsal skin with 1 to 1.5 x l07 promastigotes of Leishmania species and progression of subsequent lesions were evaluated for up to 16 weeks post infection. The golden hamster was selected because it is considered the adequate bio-model to evaluate drugs against Leishmania as they are susceptible to infection by different species. Cutaneous infection of hamsters results in chronic but controlled lesions, and a clinical evolution with signs similar to those observed in humans. Therefore, the establishment of the extent of infection by measuring the size of the lesion according to the area of indurations and ulcers is feasible. This approach has proven its versatility and easy management during inoculation, follow up and characterization of typical lesions (ulcers), application of treatments through different ways and obtaining of clinical samples after different treatments. By using this method the quality of animal life regarding locomotion, search for food and water, play and social activities is also preserved.

Optimization of the experimental hamster model for cutaneous leishmaniasis by intradermal injection of Leishmania promastigotes at the dorsal skin. This approach is useful during inoculation, follow-up, characterization of lesions, application of treatments and obtaining of clinical samples. Locomotion, search for food and water, play and social activities are preserved.

Kutane Leishmaniose in der Rückenhaut von Hamstern: ein nützliches Modell für das Screening von Drogen leishmanientötende

Traditionally, hamsters are experimentally inoculated in the snout or the footpad. However in these sites an ulcer not always occurs, measurement of ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of glass-supported planar bilayers and in vitro-derived T-cell clones or lines1,2,3,4. How these findings apply to the primary human T cells isolated from blood or lymphoid tissues is not known, partly due to significant difficulties in obtaining a sufficient number of cells for analysis5. Here we address this through the development of a technique exploiting multichannel flow slides to build planar lipid bilayers containing activating and adhesion molecules. The low height of the flow slides promotes rapid cell sedimentation in order to synchronize cell:bilayer attachment, thereby allowing researchers to study the dynamic of the synaptic interface formation and the kinetics of the granules release. We apply this approach to analyze the synaptic interface of as few as 104 to 105 primary cryopreserved T cells isolated from lymph nodes (LN) and peripheral blood (PB). The results reveal that the novel planar lipid bilayer technique enables the study of the biophysical properties of primary human T cells derived from blood and tissues in the context of health and disease.

The protocol describes a technique to study the ability of primary polyclonal human T cells to form synaptic interfaces using planar lipid bilayers. We use this technique to show the differential synapse formation capability of human primary T cells derived from lymph nodes and peripheral blood.

Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, Candida can overgrow their natural niches resulting in debilitating mucosal infections as well as life-threatening systemic infections, which are a major focus of investigation due to their associated high mortality rates. Animal models of disseminated infection exist for studying disease progression and dissecting the characteristics of Candida pathogenicity. Of these, the Galleria mellonella waxworm infection model provides a cost-effective experimental tool for high-throughput investigations of systemic virulence. Many other bacterial and eukaryotic infectious agents have been effectively studied in G. mellonella to understand pathogenicity, making it a widely accepted model system. Yet, variation in the method used to infect G. mellonella can alter phenotypic outcomes and complicate interpretation of the results. Here, we outline the benefits and drawbacks of the waxworm model to study systemic Candida pathogenesis and detail an approach to improve reproducibility. Our results highlight the range of mortality kinetics in G. mellonella and describe the variables which can modulate these kinetics. Ultimately, this method stands as an ethical, rapid, and cost-effective approach to study virulence in a model of disseminated candidiasis.

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella serves as an invertebrate model for disseminated candidiasis. Here, we detail the infection protocol and provide supporting data for the model&#39;s effectiveness.

Die Galleria Mellonella Waxworm Infektionsmodell für verbreitet Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal host-microbe interactions. It is well established that different commensals exhibit a different potential to stimulate the host intestinal immune system. Such investigations involve vertebrate animals, especially rodents. Since increasing ethical concerns are linked with experiments involving vertebrates, there is a high demand for invertebrate replacements models. 
Here, we provide a Galleria mellonella oral administration model using commensal non-pathogenic bacteria and the possible assessment of the immunogenic potential of commensals on the G. mellonella immune system. We demonstrate that G. mellonella is a useful alternative invertebrate replacement model that allows the analysis of commensals with different immunogenic potential such as Bacteroides vulgatus and Escherichia coli. Interestingly, the bacteria exhibited no killing effect on the larvae, which is similar to mammals. The immune responses of G. mellonella were comparable with vertebrate innate immune responses and involve recognition of the bacteria and production of antimicrobial molecules. We propose that G. mellonella was able to restore previous microbiota balance, which is well known from healthy mammalian individuals. Although providing comparable innate immune responses in both G. mellonella and vertebrates, G. mellonella does not harbor an adaptive immune system. Since the investigated components of the innate immune system are evolutionary conserved, the model allows a prescreening and first analysis of bacterial immunogenic properties.

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Here, we provide a detailed protocol for an oral administration model using Galleria mellonella larvae and how to characterize induced innate immune responses. Using this protocol, researchers without practical experience will be able to use the G. mellonella force-feeding method.

Ein Galleria Mellonella mündliche Administrationsmodell zu Study Commensal-Induced angeborene Immunantwort

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...