Gli autori desiderano ringraziare José Luis Ramos-Balderas per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalla seguente sovvenzione a PLL da parte di CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P e EO-M hanno ricevuto una borsa di studio da CONACYT (rispettivamente 736162 e 481437). MCM-M ha ricevuto una borsa di studio da CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).

Tutti gli esperimenti sugli animali qui descritti sono stati approvati dal Comitato interno per la gestione degli animali (CICUAL) dell'Istituto di fisiologia cellulare, Università Nazionale Autonoma del Messico.
NOTA: nella Figura 1 è illustrato un diagramma di flusso dell'intero protocollo.
1. Alloggiamento dei topi
<ol><li>Utilizzare gruppi di topi di 8-10 settimane, femmine o maschi, alloggiati in strutture per animali con temperatura e umidità costanti in cicli luce/buio di 12 ore, con accesso ad libitum ad acqua e cibo. NOTA: Questo protocollo utilizza un ceppo di topo reporter IL-9 in background C57BL/6, come descritto in precedenza4; tuttavia, altri ceppi reporter IL-9 potrebbero essere utilizzati 6,7,8, così come la colorazione intracellulare IL-9, con risultati variabili 9.</li>
</ol>2. Infezione dei topi
<ol><li>Radere la parte posteriore dei topi dal centro del corpo vicino alla base della coda 1 giorno prima dell'infezione. L'uso di anestetici non è essenziale.</li>
	<li>Inocula sottocutaneamente ogni topo con 200 larve vitali di N. brasiliensis di terzo stadio (L3) in 100 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS)10 nella parte bassa della schiena, come precedentemente descritto2,11, o iniettare 100 μL di PBS da solo come controllo. Sacrifica gli animali il giorno 4, il giorno 7 o il giorno 10 dopo l'infezione.</li>
</ol>3. Isolamento dei linfonodi polmonari, dell'intestino tenue, del mediastino e mesenterico
<ol><li>Eutanasia del topo per dislocazione cervicale. Posizionare il mouse sul dorso e spruzzarlo con etanolo al 70%. Fai un'incisione della linea mediana usando le forbici e apri la pelle per esporre le aree addominali e toraciche. NOTA: L'isoflurano può essere usato come metodo alternativo di eutanasia12. Le camere ad anidride carbonica non sono raccomandate, poiché la CO2 porta a danni ai tessuti polmonari ed emorragia13.</li>
	<li>Isolamento dei linfonodi mediastinici e dei polmoni<ol><li>Fare un'incisione allo sterno e tagliare a forma di "V" per rimuovere le costole e i muscoli toracici. Una volta esposta la cavità toracica, individuare i linfonodi mediastinici vicino all'esofago, sotto il cuore (vedere Figura supplementare 1).</li>
		<li>Estrarre i linfonodi mediastinici e raccoglierli in 1 ml di terreno R-10 (Tabella 1) in una piastra di coltura a 12 pozzetti. Conservare in ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla lavorazione. NOTA: I campioni devono essere protetti dalla luce, per evitare di diminuire il segnale fluorescente dei topi reporter utilizzati in questi esperimenti.</li>
		<li>Estrarre i polmoni e raccoglierli in 1 ml di terreno R-10 in una piastra di coltura a 12 pozzetti per topo. Conservare in ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla lavorazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento delle catene linfonodali mesenteriche e dell'intestino tenue<ol><li>Esporre la cavità peritoneale e spostare con attenzione l'intestino tenue verso destra per esporre la catena linfonodale mesenterica (MLN) lungo il colon.</li>
		<li>Usando una pinza, rimuovere l'MLN, arrotolarlo delicatamente su un tovagliolo di carta e rimuovere il grasso.</li>
		<li>Trasferire l'MLN a 1 mL di terreno R-10 in una piastra di coltura a 12 pozzetti. Conservare in ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla lavorazione.</li>
		<li>Tagliare l'intestino tenue appena sotto lo sfintere pilorico e sopra il cieco. Tirare fuori lentamente l'intestino con l'aiuto di una pinza, rimuovendo il mesentere attaccato e il tessuto adiposo.</li>
		<li>Posizionare l'intestino tenue su un tovagliolo di carta e inumidirlo generosamente con PBS. Rimuovere i cerotti di Peyer dall'intestino tenue con le forbici. NOTA: Per mantenere la vitalità, rimuovere il tessuto adiposo rimanente e mantenere l'intestino tenue umido con PBS durante l'intero processo.</li>
		<li>Tagliare l'intestino tenue longitudinalmente usando le forbici e far scorrere delicatamente la pinza sull'intestino aperto per rimuovere il contenuto fecale e il muco.</li>
		<li>Tenere l'intestino tenue con una pinza e lavarlo in 5 ml di PBS sul ghiaccio immergendolo accuratamente alcune volte. Ripeti due volte.</li>
		<li>Tagliare l'intestino tenue in pezzi corti (circa 5 mm) e raccoglierli in un tubo conico da 50 mL con 10 mL di HBSS14 con FBS al 2% (Tabella 1). Continuare immediatamente a isolare le cellule intraepiteliali e lamina propria.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Preparazione di sospensioni unicellulari dall'intestino tenue, dal polmone e dai linfonodi
NOTA: È estremamente importante elaborare un massimo di sei topi per persona quando si preparano sospensioni unicellulari dall'intestino tenue, poiché la vitalità cellulare diminuisce significativamente con periodi di elaborazione più lunghi. Questo metodo è stato adattato dal modello 5 del topo di infezione da Heligmosomoides polygyrus.
<ol><li>Preriscaldare l'incubatore vibrante, il mezzo R-20, HBSS e HBSS-2 mM EDTA (Tabella 1) a 37 °C.</li>
	<li>Preparare 10 ml di terreno di digestione dell'intestino tenue (Tabella 1) per campione.</li>
	<li>Agitare vigorosamente a mano i pezzi dell'intestino dal punto 3.3.8.</li>
	<li>Filtrare ogni campione attraverso una rete di nylon (circa 10 cm x 10 cm) su un imbuto di vetro. Lavare il campione aggiungendo 10 ml di HBSS preriscaldato sulla rete ed eliminare il flusso continuo. Ripeti ancora una volta. NOTA: utilizzare una nuova mesh per ogni campione e riutilizzarla durante tutta la procedura.</li>
	<li>Rimuovere la maglia dall'imbuto e raccogliere il campione dalla maglia in un tubo conico da 50 mL con 10 mL di HBSS-2 mM EDTA caldo (fase 4.1). Incubare per 10 minuti a 37 °C, agitando a 200 giri/min.</li>
	<li>Vortice per 10 s alla massima velocità (3.200 giri/min) e filtrare il campione con la maglia su un imbuto di vetro, recuperando il flusso in un tubo conico da 50 ml.</li>
	<li>Ripetere due volte i punti 4.5 e 4.6, recuperando il flusso nello stesso tubo conico da 50 ml. Le cellule intraepiteliali si trovano in questa frazione di 30 ml. Salvare il tessuto rimanente.</li>
	<li>Preparazione di sospensione unicellulare da cellule intraepiteliali<ol><li>Centrifugare i 30 mL di sospensione cellulare, recuperati nella fase 4.7, a 450 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 5 ml di PBS e centrifugare a 450 x g per 5 minuti a RT. Eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNasi (Tabella 1). Conservare sul ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla colorazione cellulare.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della sospensione unicellulare da cellule della lamina propria<ol><li>Lavare il tessuto dell'intestino tenue rimanente dal punto 4.7 versando oltre 10 ml di HBSS caldo attraverso la rete sopra l'imbuto. Ripetere il lavaggio. Raccogliere il tessuto dalla rete in un tubo conico da 50 ml con 10 ml di terreno di digestione dell'intestino tenue.</li>
		<li>Incubare per 30 minuti a 37 °C, agitando a 200 giri/min. Vortice alla massima velocità per 10 s ogni 5 min.</li>
		<li>Aggiungere 10 ml di tampone FACS-EDTA (Tabella 1) per interrompere la reazione di digestione e posizionarlo sul ghiaccio.</li>
		<li>Filtrare ogni campione attraverso un filtro cellulare da 100 μm utilizzando una pipetta sierologica, recuperando la sospensione in un tubo conico da 50 mL posto su ghiaccio.</li>
		<li>Centrifugare a 600 x g per 6 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Scartare il surnatante. Lavare il pellet cellulare con 5 mL di PBS e centrifugare a 600 x g per 6 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di RPMI 10% FBS-20 μg/mL DNasi. Conservare sul ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla colorazione cellulare.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della sospensione unicellulare dal polmone NOTA: Ogni polmone e intestino tenue devono essere trattati in parallelo da due persone per evitare tempi di manipolazione prolungati, che si traducono in una bassa vitalità cellulare.<ol><li>Preparare 4 ml di terreno di digestione polmonare (Tabella 1) per campione elaborato.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo RPMI dal pozzetto contenente i polmoni dal punto 3.2.3. Tagliare il polmone a pezzetti con le forbici sottili.</li>
		<li>Trasferire i pezzi polmonari in un tubo conico da 15 mL con una spatola. Aggiungere 4 ml di terreno di digestione polmonare (Tabella 1).</li>
		<li>Incubare per 30 minuti a 37 °C, agitando a 250 giri/min. Al termine, conservare in ghiaccio fino a quando ogni campione non viene elaborato.</li>
		<li>Filtrare ogni campione attraverso un filtro cellulare da 100 μm, posizionato in un singolo pozzetto di una piastra di coltura a 6 pozzetti. Dissociare il tessuto con uno stantuffo della siringa.</li>
		<li>Recuperare ogni campione in una provetta conica da 15 mL e aggiungere 4 mL di terreno R-2 (Tabella 1). Conservare in ghiaccio mentre gli altri campioni vengono elaborati.</li>
		<li>Centrifugare a 600 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno R-5 (Tabella 1).</li>
		<li>Durante la centrifugazione, preparare 4 ml di soluzione con gradiente di densità al 27,5% (Tabella 1) per campione per arricchire la frazione cellulare ematopoietica15,16. Questa strategia per la separazione a cella singola è più efficiente, economica e meno tossica rispetto ad altri mezzi a gradiente di densità simili17.</li>
		<li>Aggiungere 4 mL di soluzione con gradiente di densità al 27,5% all'1 mL di sospensione cellulare del punto 4.10.7 e agitare energicamente.</li>
		<li>Aggiungere lentamente 1 mL di mezzo R-5 (Tabella 1) sopra la sospensione mista per creare due fasi.</li>
		<li>Centrifugare a 1.500 x g per 20 minuti a RT, con bassa accelerazione e freno spento. Osservare l'anello formato tra le due fasi.</li>
		<li>Recuperare l'anello formato tra le due fasi con una micropipetta da 1 mL e risospendere in 4 mL di terreno R-2.</li>
		<li>Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone ACK (Tabella 1) e incubare per 1 minuto a RT.</li>
		<li>Aggiungere 4 mL di terreno R-5 e centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno R-10. Conservare sul ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla colorazione per la citometria a flusso.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione della sospensione unicellulare dai linfonodi<ol><li>Posizionare i linfonodi dei punti 3.2.2 o 3.3.3 tra due pezzi di maglia in un pozzetto da una piastra di coltura a 6 pozzetti e dissociarli con uno stantuffo della siringa.</li>
		<li>Recuperare la sospensione cellulare in un tubo conico da 1,5 mL e centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno R-10. Conservare sul ghiaccio, al riparo dalla luce fino alla colorazione per la citometria a flusso. NOTA: se sono visibili grumi, filtrare il campione attraverso un filtro cellulare da 100 μm.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Colorazione cellulare per citometria a flusso (Figura 2 e Figura 3)
NOTA: Centrifugare le sospensioni delle cellule linfonodali dal punto 4.11.3 a 450 x g per 5 minuti a 4 °C e risospendere il pellet cellulare in 500 μL di tampone FACS (Tabella 1).
<ol><li>Colorazione cellulare per l'identificazione di ILC2 (Figura 3 e Figura supplementare 2) NOTA: Questa procedura di colorazione è specifica per l'identificazione delle cellule ILC2 che esprimono IL-9.<ol><li>Piastra 150 μL per campione polmonare (circa 1,8 x 10 6 cellule) dal passo 4.10.14 e 50 μL per campione linfonodale dalla fase 4.11.3 (circa 0,7 x 106 e 2,2 x 106 cellule per campioni di linfonodi mediastinici e mesenterici, rispettivamente) in una piastra di coltura inferiore conica a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μL di tampone FACS e centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Piastra 100 μL per campione di intestino tenue (circa 2,7 x 10 6 e 0,6 x 106 cellule per campioni intraepiteliali e lamina propria, rispettivamente) dai punti 4.8.3 e 4.9.7 in una piastra di coltura inferiore conica a 96 pozzetti. Aggiungere 150 μL di tampone FACS e centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere ogni pellet cellulare in 50 μL del cocktail di anticorpi biotinilati (Tabella 2) diluito nel tampone FACS. Incubare per 30 minuti a 4 °C al riparo dalla luce. NOTA: Utilizzare tampone FACS con 20 μg/mL DNasi per campioni intraepiteliali e di lamina propria.</li>
		<li>Aggiungere 150 μL di tampone FACS. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone FACS. Centrifugare di nuovo e scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 50 μL del cocktail anticorpo/macchia (Tabella 2) e incubare per 30 minuti a 4 °C al riparo dalla luce.</li>
		<li>Aggiungere 150 μL di tampone FACS. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 μL di tampone FACS. Centrifugare di nuovo e scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio (punto 5.1.7) ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 300 μL di tampone FACS e analizzarlo mediante citometria a flusso.</li>
		<li>Per i campioni dell'intestino tenue e del polmone, utilizzare la strategia di gating: linfociti, cellule singole, cellule vive, cellule ematopoietiche, cellule CD90 + lignaggio, cellule ST2 + e cellule IL-9 + (Figura 3A, B e Figura supplementare 2A). Per i campioni linfonodali, utilizzare la strategia di gating: cellule vive, cellule singole, cellule di lignaggio CD90+, cellule ST2+ e cellule IL-9+ (Figura supplementare 2B,C).</li>
	</ol></li>
	<li>Colorazione cellulare per l'identificazione dei linfociti produttori di IL-9 (Figura 2 e Figura 3 supplementare)<ol><li>Trasferire 800 μL per campione polmonare dalla fase 4.10.14 a una provetta da 1,5 mL (circa 14,6 x 106 cellule). Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante.</li>
		<li>Per i campioni linfonodali, piastra 400 μL della sospensione cellulare dal punto 4.11.3 (circa 5,6 x 10 6 e 17,5 x 106 cellule per campioni di linfonodi mediastinici e mesenterici, rispettivamente) in una piastra inferiore conica a 96 pozzetti in due fasi.<ol><li>Trasferire prima 200 μL, centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.</li>
			<li>Trasferire altri 200 μL al pozzetto corrispondente. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.</li>
		</ol></li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 50-400 μL del cocktail anticorpo/colorante (Tabella 3) e incubare per 30 minuti a 4 °C al riparo dalla luce. NOTA: I campioni polmonari devono essere risospesi in 400 μL, i campioni di linfonodi mediastinici in 50 μL e i campioni di linfonodi mesenterici in 100 μL del cocktail di colorazione.</li>
		<li>Aggiungere 150 μL di tampone FACS ai campioni di linfonodi mediastinici e 100 μL ai campioni di linfonodi mesenterici. Centrifugare a 450 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Lavare i campioni di polmone e linfonodi risospendendo i pellet rispettivamente in 1 mL e 200 μL di tampone FACS. Centrifugare a 450 xg per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e ripetere il lavaggio.</li>
		<li>Risospendere i campioni polmonari in 600 μL di tampone FACS e analizzarli mediante citometria a flusso. Utilizzare la strategia di gating: linfociti, cellule singole, cellule vive, cellule ematopoietiche, cellule CD4+TCRβ+ e cellule IL-9+ (Figura 2A).</li>
		<li>Risospendere i campioni linfonodali in 300 μL di tampone FACS e analizzarli mediante citometria a flusso. Utilizzare la strategia di gating: linfociti, cellule singole, cellule vive, cellule TCRβ+ CD4+ e cellule IL-9+ (Figura 2B e Figura 3A supplementare).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Determinazione del numero assoluto di cellule in sospensioni monocellulari
<ol><li>Diluire i campioni dalle fasi di isolamento 4.8.3, 4.9.7, 4.10.14 e 4.11.3 con PBS in rapporto 1:20 (10 μL di campione + 190 μL di PBS).</li>
	<li>Mescolare 10 μL di ciascun campione diluito del punto 6.1 con 10 μL di Trypan Blue. Caricare 10 μL in un emocitometro e contare le cellule vive, considerando ogni diluizione.</li>
	<li>Ottenere il numero assoluto di cellule moltiplicando la percentuale della popolazione di interesse da cellule vive determinata dalla citometria a flusso (cellule negative al colorante di vitalità) per il numero totale di cellule vive nella sospensione unicellulare dopo l'isolamento e dividendo questo numero per 100 (Figura supplementare 4, Figura supplementare 5 e Figura supplementare 6). Numero assoluto = (Percentuale della popolazione di interesse da cellule vive determinata dalla citometria a flusso x Numero totale di cellule vive nella sospensione unicellulare)/100</li>
</ol>

<ol>
	<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasites - Hookworm. , (2022).</li><li>Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+of+Nippostrongylus+brasiliensis+and+Heligmosomoides+polygyrus.">Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus.</a> Current Protocols in Immunology. , (2003).</li><li>Mearns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-4-promoted+T+helper+2+responses+enhance+Nippostrongylus+brasiliensis-induced+pulmonary+pathology.">Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology.</a> Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).</li><li>Licona-Limon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+drive+host+immunity+against+gastrointestinal+worm+infection.">Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection.</a> Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).</li><li>Ferrer-Font, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+analysis+of+intestinal+immune+cells+during+helminth+infection.">High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection.</a> Elife. 9, 51678 (2020).</li><li>Kharwadkar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+efficiency+of+multiple+IL9+reporter+alleles+Is+determined+by+cell+lineage.">Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage.</a> Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).</li><li>Wilhelm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+IL-9+fate+reporter+demonstrates+the+induction+of+an+innate+IL-9+response+in+lung+inflammation.">An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).</li><li>Gerlach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TH9+cells+that+express+the+transcription+factor+PU.1+drive+T+cell-mediated+colitis+via+IL-9+receptor+signaling+in+intestinal+epithelial+cells.">TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).</li><li>Olson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+IL-2+is+required+for+optimal+type+2+effector+cytokine+production.">Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production.</a> Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).</li><li>Cold Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate-buffered+saline+(PBS).">Phosphate-buffered saline (PBS).</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Th9+cells+and+parasitic+inflammation:+Use+of+Nippostrongylus+and+Schistosoma+models.">Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models.</a> Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).</li><li>Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+isoflurane+and+CO2+inhalation+on+plasma+levels+of+inflammatory+markers+associated+with+collagen-induced+arthritis+in+DBA+mice.">Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice.</a> International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+behavioral,+and+histologic+responses+to+various+euthanasia+methods+in+C57BL/6Ntac+male+mice.">Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>old Spring Harbor Protocols. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hank's+balanced+salt+solution+(HBSS)+without+phenol+red.">Hank's balanced salt solution (HBSS) without phenol red.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).</li><li>Bielecki, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-resident+innate+lymphoid+cells+converge+on+a+pathogenic+effector+state.">Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state.</a> Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).</li><li>Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+effects+of+TGF-beta+and+IL-15+cytokines+control+the+number+of+short-lived+effector+CD8++T+cells.">Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells.</a> Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).</li><li>Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single-cell+encapsulation+efficiency+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspension.">Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension.</a> Micromachines. 11 (1), 94 (2020).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-25-responsive,+lineage-negative+KLRG1(hi)+cells+are+multipotential+'inflammatory'+type+2+innate+lymphoid+cells.">IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential 'inflammatory' type 2 innate lymphoid cells.</a> Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S1P-dependent+interorgan+trafficking+of+group+2+innate+lymphoid+cells+supports+host+defense.">S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense.</a> Science. 359 (6371), 114-119 (2018).</li><li>Flamar, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-33+induces+the+enzyme+Tryptophan+hydroxylase+1+to+promote+inflammatory+group+2+innate+lymphoid+cell-mediated+immunity.">Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity.</a> Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).</li><li>Olgu&#237;n-Mart&#237;nez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-33+and+the+PKA+pathway+regulate+ILC2+populations+expressing+IL-9+and+ST2.">IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2.</a> Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).</li><li>Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+molecular+markers+and+heterogeneity+in+type+2+innate+lymphoid+cells.">Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells.</a> Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).</li><li>Noelle, R. J., Nowark, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+sources+and+immune+functions+of+interleukin-9.">Cellular sources and immune functions of interleukin-9.</a> Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Una comprensione completa delle interazioni parassita-ospite intestinale e delle risposte immunitarie all'infezione da elminti richiede l'identificazione e l'analisi delle diverse popolazioni cellulari e delle molecole effettrici che sono fondamentali per l'induzione del rimodellamento tissutale e l'espulsione dei vermi. Le infezioni da elminti trasmesse dal suolo rappresentano un grosso problema nei paesi in via di sviluppo di tutto il mondo. Tuttavia, fino a poco tempo fa, nonera disponibile un ...

Gli anchilostomi sono parassiti intestinali che infettano circa 700 milioni di persone in tutto il mondo, soprattutto nelle aree tropicali dei paesi sottosviluppati. Le infezioni ad alta intensità da Ancylostoma duodenale e Necator americanus, i parassiti anchilostomi più comuni nell'uomo, causano anemia e carenza proteica che possono causare ritardo della crescita e dello sviluppo mentale1. N. americanus e il parassita dei roditori Nippostrongylus brasiliensis inducono una risposta immunitaria prototipica di tipo 2 nel loro ospite e condividono somiglianze nel loro ciclo vitale. Quindi, l'infezione dei topi con N. brasiliensis è il modello più comunemente usato per le infezioni da anchilostomi umani. Stadio 3 (L3) N. brasiliensis larve infettive si spostano dalla pelle al polmone nelle prime ore dopo l'infezione. Una volta nel polmone, diventano L4 e migrano lungo la trachea per essere inghiottiti, passare attraverso lo stomaco e raggiungere l'intestino per diventare adulti (L5) entro 4-5 giorni. Nell'intestino, i vermi L5 depongono le uova che vengono escrete nelle feci per riavviare il ciclo di vita del parassita2.
La risposta immunitaria indotta da N. brasiliensis è caratterizzata da un aumento di diverse citochine di tipo 2, tra cui IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13, insieme a eosinofilia, basofilia, iperplasia del calice e dei mastociti e aumento della produzione di IgG1 e IgE. La maggior parte degli studi che cercano di identificare e definire le risposte immunitarie suscitate dall'infezione da N. brasiliensis sono incentrati sul ruolo di IL-4 o IL-13 in questo modello3. Tuttavia, l'identificazione e la caratterizzazione delle cellule che esprimono IL-9 e la funzione di questa citochina erano state ampiamente trascurate, fino a quando Licona-Limón et al. hanno pubblicato il primo studio che dimostrava un ruolo critico per IL-9 nella risposta immunitaria contro N. brasiliensis. Utilizzando topi reporter, questo studio ha descritto le cellule T (principalmente T helper 9) e le cellule linfoidi innate di tipo 2 (ILC2) come i principali sottogruppi cellulari che esprimono IL-9 dopo l'infezione4.
L'isolamento e la caratterizzazione di cellule immunitarie da polmoni infetti da elminti è fattibile, ed è stato ampiamente riportato 3,4. Tuttavia, a causa del rimodellamento dei tessuti intrinseco e della produzione di muco, farlo nell'intestino infetto si è rivelata una sfida tecnica, fino alla recente pubblicazione di Ferrer-Font et al.5. Il gruppo ha delineato un protocollo per isolare e analizzare sospensioni a singola cellula di sottogruppi immunitari da intestini murini infetti da Heligmosomoides polygyrus. Sulla base di esso, abbiamo ora standardizzato un protocollo per l'isolamento e l'analisi citometrica delle cellule linfoidi che esprimono IL-9 dall'intestino infetto da N. brasiliensis. Inoltre, abbiamo stabilito la cinetica di IL-9 da diverse fonti cellulari e posizioni anatomiche durante l'infezione.
Caratterizzare le distinte popolazioni cellulari coinvolte in questa infezione è vitale per una più ampia comprensione della risposta immunitaria al parassita e della sua interazione con l'ospite. Questo protocollo completo fornisce un percorso chiaro per isolare e analizzare le cellule produttrici di IL-9 dagli organi desiderati nelle fasi della malattia di interesse, consentendo un netto miglioramento delle conoscenze sul ruolo di queste cellule nell'infezione da N. brasiliensis e nelle infezioni parassitarie in generale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ACK buffer</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune Nxt cytometer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11c&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 (BV421)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.2</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088866001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18068015</td>
			<td>Specific activity: &#8805;10 000 units/mg&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Facs ARIA II sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Melody cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc-Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc&#949;RI</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13589885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analysis data software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1</td>
			<td>Tonbo</td>
			<td>305931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>514103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon mesh</td>
			<td>&#160;&#8206; lba</td>
			<td>B07HYHHX5V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siglec F&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>155512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>405206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946; (PE/Cy7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#947;&#948;&#160;</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>118103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine buffer&#160;</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423101</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for the study of il-9-producing lymphoid cells in the nippostrongylus brasiliensis infection model

IL-9 è una citochina pleiotropica associata a vari processi, tra cui l'immunità antitumorale, l'induzione di patologie allergiche e la risposta immunitaria contro le infezioni da elminti, dove svolge un ruolo importante nell'espulsione del parassita. In un modello murino di infezione da Nippostrongylus brasiliensis, IL-9 è prodotta principalmente dai linfociti T CD4 + e dalle cellule linfoidi innate presenti nel polmone, nell'intestino tenue e nei linfonodi drenanti. Date le difficoltà tecniche coinvolte nella colorazione intracellulare di IL-9, così come la complessità di isolare le cellule ematopoietiche dall'intestino tenue dopo l'infezione, vi è una pressante necessità di un protocollo completo ma semplice per analizzare l'espressione di IL-9 in diversi tessuti linfoidi e non linfoidi in questo modello. Il protocollo qui descritto delinea la cinetica di IL-9 prodotta dalle cellule T CD4+ e dalle cellule linfoidi innate nel polmone e nell'intestino tenue, i principali organi bersaglio di N. brasiliensis, nonché nei linfonodi mediastinici e mesenterici, durante l'infezione. Inoltre, descrive in dettaglio il numero di larve necessarie per l'infezione, a seconda del tipo di cellula e dell'organo di interesse. Questo protocollo mira ad assistere nella standardizzazione dei saggi per risparmiare tempo e risorse offrendo l'opportunità di concentrarsi sulle cellule, gli organi e gli stadi specifici della malattia di interesse nel modello di infezione da N. brasiliensis.

I topi sono stati iniettati per via sottocutanea con 200 larve di N. brasiliensis in stadio L3 o con PBS per controlli fittizi. Il numero di larve utilizzate in questo protocollo è stato regolato al fine di isolare le cellule vitali dai polmoni, dal tessuto linfoide e dall'intestino tenue, a differenza dei rapporti precedenti in cui sono stati utilizzati carichi più elevati di vermi per rilevare le cellule nei tessuti linfoidi e nei polmoni solo4. I polmoni, i linfonodi mediastinici, i ...

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model at JoVE.com

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

Le cellule T e ILC2 che esprimono IL-9 sono indotte durante l'infezione da N. brasiliensis , ma la loro caratterizzazione è stata ampiamente trascurata nell'intestino infetto a causa della loro bassa frequenza e cinetica differenziale. Questo protocollo descrive l'isolamento di queste cellule da diversi organi bersaglio e la conferma della loro identità tramite citometria a flusso in diversi stadi di infezione.

Una strategia per lo studio delle cellule linfoidi produttrici di IL-9 nel modello di infezione da Nippostrongylus brasiliensis

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

This protocol allows for the isolation and characterization of lymphoid cells expressing IL-9 in N.brasiliensis non-lymphoid infected tissues including the infected cut which recently was technically invisible.This protocol also provides an alternative to analyze populations of cells from peripheral tissues previously unappreciated in infection due to the intrinsic difficulties of isolating cells from these anatomical sites.This method allows the study of difficult-to-isolate populations from N.brasiliensis infected cut and could be applied to other helminthic infections, broadening our understanding of hookworm infections in humans.Demonstrating the procedure will be Ofelia Mu

a-strategy-for-study-il-9-producing-lymphoid-cells-nippostrongylus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

1.2K Views.  Universidad Nacional Autónoma de México. This protocol allows for the isolation and characterization of lymphoid cells expressing IL-9 in N.brasiliensis non-lymphoid infected tissues including the infected cut which recently was technically invisible.This protocol also provides an alternative to analyze populations of cells from peripheral tissues previously unappreciated in infection due to the intrinsic difficulties of isolating cells from these anatomical sites.This method allows the study of difficult-to-isolate populations from...