La importancia de este protocolo es probar la probabilidad bruta de enteroides en un modelo in vitro de epitelio prematuro. La principal ventaja de esta técnica es medir la permeabilidad de un lumen cerrado que imita el ambiente luminal intestinal. Este protocolo se puede utilizar para estudiar los factores que inducen o atenúan la enfermedad del intestino permeable.
También se puede aplicar a los sistemas endoteliales o vasculares para estudiar las condiciones que pueden inducir fugas vasculares. Este protocolo requiere algo de práctica. Recomendamos practicar cada sección por separado antes de armar todo el procedimiento.
Para comenzar, transfiera los segmentos intestinales a una placa de Petri de 60 por 15 milímetros cuadrados con PBS de Dulbecco helado con anfoteracina y remoje durante 20 minutos en hielo. Usando un bisturí con un par de tijeras, corte los segmentos del intestino en trozos de tres a cinco milímetros y coloque uno o dos trozos en una placa de Petri de 35 por 15 milímetros cuadrados que contenga de 0,5 a un mililitro de medio de crecimiento organoide sobre hielo. Corte el tubo intestinal longitudinalmente con microtijeras y fórceps de disección.
Luego use los fórceps para raspar las células epiteliales de la fascia. Retire la fascia y agite el plato para romper los grupos de células. Luego, usando una punta cortada de pipeta de 20 microlitros, transfiera las células y los medios en un incremento de cinco a 10 microlitros a una mezcla de matriz de membrana basal para hacer una solución de 285 microlitros.
Mezcle las células pipeteando en una matriz de membrana basal sobre hielo usando una punta cortada de 200 microlitros. Después de mezclar, coloque cinco tiras de 50 microlitros de la mezcla de la matriz de membrana basal celular en un pocillo de una placa de seis pocillos precalentada mantenida en un ladrillo de espuma caliente. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 10 minutos para permitir la polimerización y un endurecimiento de la matriz de la membrana basal.
Una vez que las tiras de matriz se solidifiquen, agregue dos mililitros del medio de crecimiento enteroide en el pozo antes de volver a colocar la placa en la incubadora. Después de transferir los enteroides a un pozo de una placa de seis pocillos o 12 pocillos, cada día alterno, reemplace los medios viejos con medios nuevos. Y a medida que los enteroides han comenzado a prosperar, pasan las células cada cinco a siete días.
Para la tinción de inmunofluorescencia, agregue 500 microlitros del anticuerpo primario en el tampón de bloqueo a cada pocillo de enteroides e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos y lave los enteroides tres veces con PBS. Después de la incubación en una solución diluida de anticuerpos secundarios de uno a 400, seguida de incubación en DAPI, lave los enteroides tres veces con PBS.
Para preservar las estructuras tridimensionales de los enteroides, use recortes de láminas delgadas de caucho de silicio o hojas de cubierta de vidrio para crear un espacio de 0.5 a un milímetro entre la diapositiva de vidrio inferior y el cubreobjetos. Para el montaje, lave los enteroides teñidos con 70% de glicerol. Luego, usando un bucle de inoculación de un microlitro, o una punta cortada de 200 microlitros, levante los enteroides de la placa y monte con glicerol en un portaobjetos de microscopio de vidrio.
Prepare una placa de Petri cubierta con una cubierta de película transparente y agregue de dos a cuatro gotas de un microlitro del Dextran-FITC en la película. Con el micromanipulador, introduzca la punta de la micropipeta dentro del líquido y por encima de la película bajo un microscopio estéreo, luego tire suavemente de la jeringa para extraer la Dextran-FITC en la micropipeta. Después de llenar la micropipeta con dos a cuatro microlitros de Dextran-FITC, empuje la jeringa para eliminar el aire de la punta de la pipeta.
Además, inspeccione la columna de material inyectado en la micropipeta para asegurarse de que no haya bolsas de aire y registre el volumen de Dextran-FITC dentro de la micropipeta. A continuación, encienda la fuente de aire conectada a la bomba neumática antes de encender la bomba y ajustar la duración de la bomba a 10 a 15 milisegundos. A continuación, gire la llave de paso de la jeringa para abrir la línea desde la bomba hasta la micropipeta.
Retire los enteroides de la incubadora y coloque el plato sobre un ladrillo de espuma caliente en un recipiente cubierto para minimizar la exposición a la luz después de la microinyección. Coloque la placa de Petri con enteroides bajo el microscopio estereoscópico y mueva las perillas del micromanipulador para colocar la punta de la micropipeta en un ángulo de 35 a 45 grados con respecto a la superficie horizontal. Visualice e identifique los enteroides esféricos con el objetivo de inyectar de tres a cinco enteroides por plato.
A continuación, avance la punta a un enteroide objetivo mirando a través de los oculares del microscopio. Luego, avanzando la perilla del eje Z con un movimiento lento preciso, perfore el enteroide con la punta de la micropipeta. El avance debe detenerse una vez que la punta atraviesa la superficie enteroide, que se deprime y retrocede.
Toque el pedal de la bomba con un pie y llene el enteroide con la solución verdosa Dextran-FITC hasta que se expanda. Registre el número de bombas para calcular el volumen bombeado y la concentración de Dextran. Este protocolo mostró la caracterización de enteroides derivados del tejido fetal mediante la tinción de varios biomarcadores específicos del epitelio intestinal con anticuerpos inmunofluorescentes, confirmando su origen epitelial del intestino delgado.
Aquí se muestran enteroides en diferentes etapas. Un enteroide de siete a 10 días de edad es pequeño y grueso. Mientras que un enteroide listo para microinyección era grande con un lumen y una pared delgada.
El enteroide dos días después de la microinyección todavía contiene cantidades significativas de Dextran-FITC. La permeabilidad de los enteroides después de la microinyección se evaluó midiendo la concentración de dextrano en el medio. EGTA, conocido por aumentar la permeabilidad de la membrana en uniones estrechas, se utilizó como un control positivo.
El ensayo de medición de Dextrano muestra además que el LPS indujo una mayor permeabilidad y una mayor concentración de LPS indujo una mayor permeabilidad. Lo más importante de la fijación y tinción es no alterar la forma de los enteroides o perderlos durante el proceso. Después de la microinyección, se pueden recolectar medios para el ensayo de citoquinas y se pueden recolectar enteroides para la secuenciación de ARN.
