Il significato di questo protocollo è quello di testare la probabilità lorda di enteroidi su modello in vitro di epitelio prematuro. Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di misurare la permeabilità da un lume chiuso che imita l'ambiente luminale intestinale. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i fattori che inducono o attenuano la malattia intestinale permeabile.
Può anche essere applicato ai sistemi endoteliali o vascolari per studiare le condizioni che possono indurre perdite vascolari. Questo protocollo richiede un po' di pratica. Si consiglia di praticare ogni sezione separatamente prima di mettere insieme l'intera procedura.
Per iniziare, trasferire i segmenti intestinali in una capsula di Petri di 60 per 15 millimetri quadrati con PBS di Dulbecco ghiacciato con amfoteracina e immergere per 20 minuti sul ghiaccio. Usando un bisturi con un paio di forbici, tagliare i segmenti dell'intestino in pezzi da tre a cinque millimetri e posizionare uno o due pezzi in una piastra di Petri di 35 per 15 millimetri quadrati contenente da 0,5 a un millilitro di terreno di crescita organoide su ghiaccio. Tagliare il tubo intestinale longitudinalmente usando micro-forbici e pinze da dissezione.
Quindi utilizzare la pinza per raschiare le cellule epiteliali dalla fascia. Rimuovere la fascia e ruotare il piatto per rompere i grumi cellulari. Quindi, utilizzando una punta di taglio per pipetta da 20 microlitri, trasferire le celle e i mezzi con un incremento da cinque a 10 microlitri in una miscela di matrice di membrana basale per ottenere una soluzione da 285 microlitri.
Mescolare le cellule pipettando in una matrice di membrana basale su ghiaccio usando una punta di taglio da 200 microlitri. Dopo la miscelazione, posizionare cinque strisce da 50 microlitri della miscela di matrice della membrana basale della cella in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti preriscaldata mantenuta su un mattone di schiuma calda. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica per 10 minuti per consentire la polimerizzazione e un indurimento della matrice della membrana basale.
Una volta solidificate le strisce della matrice, aggiungere due millilitri del mezzo di crescita enteroide nel pozzetto prima di rimettere la piastra nell'incubatore. Dopo aver trasferito gli enteroidi in un pozzetto di una piastra a sei o 12 pozzetti, a giorni alterni, sostituire i vecchi mezzi con mezzi freschi. E quando gli enteroidi hanno iniziato a prosperare, passano le cellule ogni cinque-sette giorni.
Per la colorazione con immunofluorescenza, aggiungere 500 microlitri dell'anticorpo primario nel tampone bloccante a ciascun pozzetto di enteroidi e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione anticorpale e lavare gli enteroidi tre volte con PBS. Dopo l'incubazione in una soluzione di anticorpi secondari diluita da uno a 400, seguita dall'incubazione in DAPI, lavare gli enteroidi tre volte con PBS.
Per preservare le strutture tridimensionali degli enteroidi, utilizzare ritagli di sottili fogli di gomma siliconica o vetrini di copertura per creare uno spazio da 0,5 a un millimetro tra il vetrino inferiore e il vetrino di copertura. Per il montaggio, lavare gli enteroidi colorati con glicerolo al 70%. Quindi, utilizzando un circuito di inoculazione da un microlitro o una punta da 200 microlitri tagliata, sollevare gli enteroidi dalla piastra e montare con glicerolo su un vetrino da microscopio.
Preparare una capsula di Petri coperta da un coperchio trasparente e aggiungere da due a quattro gocce da un microlitro di Dextran-FITC sulla pellicola. Utilizzando il micromanipolatore, guidare la punta della micropipetta all'interno del liquido e sopra la pellicola sotto uno stereomicroscopio, quindi tirare delicatamente la siringa per estrarre il Dextran-FITC nella micro pipetta. Dopo aver riempito la micropipetta con due o quattro microlitri di Dextran-FITC, spingere la siringa per rimuovere l'aria dalla punta della pipetta.
Inoltre, ispezionare la colonna di materiale iniettato nella micropipetta per assicurarsi che non vi siano sacche d'aria e registrare il volume di Dextran-FITC all'interno della micro pipetta. Quindi, accendere la fonte d'aria collegata alla pompa pneumatica prima di accendere la pompa e impostare la durata della pompa su 10-15 millisecondi. Quindi ruotare il rubinetto sulla siringa per aprire la linea dalla pompa alla micro pipetta.
Rimuovere gli enteroidi dall'incubatore e posizionare il piatto su un mattone di schiuma calda in un contenitore coperto per ridurre al minimo l'esposizione alla luce dopo la microiniezione. Posizionare la capsula di Petri con enteroidi sotto il microscopio stereoscopico e spostare le manopole del micromanipolatore per posizionare la punta della micropipetta con un angolo di 35-45 gradi rispetto alla superficie orizzontale. Visualizza e identifica gli enteroidi sferici con l'obiettivo di iniettare da tre a cinque enteroidi per piatto.
Quindi, far avanzare la punta verso un enteroide bersaglio guardando attraverso gli oculari del microscopio. Quindi, facendo avanzare la manopola dell'asse Z con un movimento lento e preciso, forare l'enteroide con la punta della micro pipetta. L'avanzamento dovrebbe fermarsi una volta che la punta attraversa la superficie enteroide, che si deprime e si stacca indietro.
Picchiettare il pedale della pompa con un piede e riempire l'enteroide con la soluzione verdastra di Dextran-FITC fino ad espandersi. Registrare il numero di pompe per calcolare il volume pompato e la concentrazione di destrano. Questo protocollo ha mostrato la caratterizzazione di enteroidi derivati dal tessuto fetale colorando vari biomarcatori specifici per l'epitelio intestinale con anticorpi immunofluorescenti, confermando la loro origine epiteliale dell'intestino tenue.
Gli enteroidi in diverse fasi sono mostrati qui. Un enteroide di età compresa tra sette e 10 giorni è piccolo e spesso. Mentre un enteroide pronto per la microiniezione era grande con un lume e una parete sottile.
L'enteroide due giorni dopo la microiniezione contiene ancora quantità significative di Dextran-FITC. La permeabilità degli enteroidi dopo microiniezione è stata valutata misurando la concentrazione di destrano nel mezzo. L'EGTA, noto per aumentare la permeabilità della membrana alle giunzioni strette, è stato utilizzato come controllo positivo.
Il test di misurazione del destrano mostra inoltre che LPS ha indotto una maggiore permeabilità e una maggiore concentrazione di LPS ha indotto una maggiore permeabilità. La cosa più importante del fissaggio e della colorazione è non interrompere la forma degli enteroidi o perderli durante il processo. Dopo la microiniezione, i terreni possono essere raccolti per il test delle citochine e gli enteroidi possono essere raccolti per il sequenziamento dell'RNA.
