A significância deste protocolo é testar a probabilidade bruta de enteroides em modelo in vitro de epitélio prematuro. A principal vantagem desta técnica é medir a permeabilidade a partir de um lúmen fechado que imita o ambiente luminal intestinal. Este protocolo pode ser usado para estudar os fatores que induzem ou atenuam a doença do intestino permeável.
Também pode ser aplicado a sistemas endoteliais ou vasculares para estudar condições que podem induzir vazamento vascular. Este protocolo requer alguma prática. Recomendamos praticar cada seção separadamente antes de colocar todo o procedimento junto.
Para começar, transfira os segmentos intestinais para uma placa de Petri de 60 por 15 milímetros quadrados com PBS de Dulbecco gelado com anfoteracina e mergulhe por 20 minutos no gelo. Usando um bisturi com um par de tesouras, corte os segmentos do intestino em três a cinco milímetros e coloque um a dois pedaços em uma placa de Petri de 35 por 15 milímetros quadrados contendo 0,5 a um mililitro de meio de crescimento organoide no gelo. Corte o tubo intestinal longitudinalmente usando microtesouras e pinças dissecantes.
Em seguida, use o fórceps para raspar as células epiteliais da fáscia. Remova a fáscia e gire o prato para quebrar os aglomerados celulares. Em seguida, usando uma ponta de corte de pipeta de 20 microlitros, transfira as células e o meio em um incremento de cinco a 10 microlitros para uma mistura de matriz de membrana basal para fazer uma solução de 285 microlitros.
Misture as células pipetando em uma matriz de membrana basal no gelo usando uma ponta de corte de 200 microlitros. Após a mistura, coloque cinco tiras de 50 microlitros da matriz de membrana basal da célula em um poço de uma placa de seis poços pré-aquecida mantida em um tijolo de espuma quente. Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 10 minutos para permitir a polimerização e o endurecimento da matriz da membrana basal.
Uma vez que as tiras de matriz estão solidificadas, adicione dois mililitros do meio de crescimento enteróide no poço antes de colocar a placa de volta na incubadora. Depois de transferir os enteróides para um poço de uma placa de seis ou 12 poços, a cada dia alternado, substitua a mídia antiga por uma nova mídia. E como os enteróides começaram a prosperar, passe as células a cada cinco a sete dias.
Para coloração por imunofluorescência, adicione 500 microlitros do anticorpo primário em tampão de bloqueio a cada poço de enteróides e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova a solução de anticorpos e lave os enteróides três vezes com PBS. Após a incubação em uma a 400 soluções de anticorpos secundários diluídos, seguida de incubação em DAPI, lavar os enteróides três vezes com PBS.
Para preservar as estruturas tridimensionais dos enteróides, use recortes de folhas finas de borracha de silício ou folhas de cobertura de vidro para criar um espaço de 0,5 a um milímetro entre a lâmina de vidro inferior e a folha de cobertura. Para montagem, lave os enteróides corados com 70% de glicerol. Em seguida, usando um laço de inoculação de um microlitro ou uma ponta de corte de 200 microlitros, levante os enteróides da placa e monte com glicerol em uma lâmina de microscópio de vidro.
Prepare uma placa de Petri coberta com uma tampa de filme transparente e adicione duas a quatro gotas de um microlitro do Dextran-FITC no filme. Usando o micromanipulador, acione a ponta da micropipeta dentro do líquido e acima do filme sob um microscópio estéreo e, em seguida, puxe suavemente a seringa para retirar o Dextran-FITC para a micropipeta. Depois de encher a micropipeta com dois a quatro microlitros de Dextran-FITC, empurre a seringa para remover qualquer ar da ponta da pipeta.
Além disso, inspecione a coluna de material injetado na micropipeta para garantir que não haja bolsa de ar e registre o volume de Dextran-FITC dentro da micropipeta. Em seguida, ligue a fonte de ar conectada à bomba pneumática antes de ligar a bomba e ajustar a duração da bomba para 10 a 15 milissegundos. Em seguida, gire a torneira na seringa para abrir a linha da bomba para a micropipeta.
Remova os enteróides da incubadora e coloque o prato em um tijolo de espuma quente em um recipiente coberto para minimizar a exposição à luz após a micro-injeção. Coloque a placa de Petri com enteróides sob o microscópio estéreo e mova os botões do micromanipulador para colocar a ponta da micropipeta em um ângulo de 35 a 45 graus em relação à superfície horizontal. Visualize e identifique os enteróides esféricos com um objetivo de injetar de três a cinco enteróides por prato.
Em seguida, avance a ponta para um enteróide alvo olhando através das oculares do microscópio. Em seguida, avançando o botão do eixo Z com um movimento lento preciso, perfure o enteróide com a ponta da micropipeta. O avanço deve parar uma vez que a ponta passa pela superfície enteróide, que deprime e estoura para trás.
Toque no pedal da bomba com um pé e encha o enteróide com a solução esverdeada de Dextran-FITC até expandir. Registre o número de bombas para calcular o volume bombeado e a concentração de Dextran. Este protocolo mostrou a caracterização de enteroides derivados do tecido fetal por coloração de vários biomarcadores específicos do epitélio intestinal com anticorpos imunofluorescentes, confirmando sua origem epitelial do intestino delgado.
Enteróides em diferentes estágios são mostrados aqui. Um enteróide de sete a 10 dias de idade é pequeno e espesso. Considerando que um enteróide pronto para micro-injeção era grande com um lúmen e parede fina.
O enteróide dois dias após a microinjeção ainda contém quantidades significativas de Dextran-FITC. A permeabilidade dos enteróides após microinjeção foi avaliada pela medição da concentração de Dextran no meio. EGTA, conhecido por aumentar a permeabilidade da membrana em junções apertadas, foi usado como um controle positivo.
O ensaio de medição de Dextran mostra ainda que o LPS induziu maior permeabilidade e maior concentração de LPS induziu maior permeabilidade. A coisa mais importante sobre a fixação e coloração é não perturbar a forma dos enteróides ou perdê-los durante o processo. Após a microinjeção, os meios podem ser coletados para o ensaio de citocinas e os enteróides podem ser colhidos para sequenciamento de RNA.
