Значение этого протокола заключается в проверке валовой вероятности энтероидов на модели in vitro преждевременного эпителия. Основным преимуществом этой методики является измерение проницаемости от замкнутого просвета, имитирующего просветную среду кишечника. Этот протокол может быть использован для изучения факторов, которые вызывают или ослабляют протекающее заболевание кишечника.
Он также может быть применен к эндотелиальной или сосудистой системе для изучения состояний, которые могут вызвать сосудистую утечку. Этот протокол требует некоторой практики. Мы рекомендуем практиковать каждый раздел отдельно, прежде чем собирать всю процедуру вместе.
Для начала переведите сегменты кишечника в чашку Петри размером 60 на 15 квадратных миллиметров с ледяным PBS Дульбекко с амфотерацином и замочите на льду в течение 20 минут. Используя скальпель с ножницами, разрежьте сегменты кишечника на три-пять миллиметровых кусочков и поместите от одного до двух кусочков в чашку Петри размером 35 на 15 квадратных миллиметров, содержащую от 0,5 до одного миллилитра органоидной питательной среды на льду. Разрезайте кишечную трубку продольно с помощью рассека микроножек и щипцов.
Затем используйте щипцы, чтобы соскоблить эпителиальные клетки с фасции. Снимите фасцию и закрутите блюдо, чтобы разбить комочки клеток. Затем, используя 20-микролитровый наконечник пипетки, перенесите ячейки и среду с шагом от пяти до 10 микролитров в матричную смесь базальной мембраны, чтобы получить 285-микролитровый раствор.
Перемешайте ячейки путем пипетирования в матрице базальной мембраны на льду с использованием 200-микролитрового режущего наконечника. После перемешивания поместите пять 50-микролитровых полосок матричной смеси клеточной базальной мембраны в одну лунку предварительно нагретой шестискважинной пластины, хранящейся на теплом пенопластовом кирпиче. Инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 10 минут, чтобы обеспечить полимеризацию и упрочнение матрицы базальной мембраны.
Как только полоски матрицы затвердеют, добавьте два миллилитра энтероидной среды роста в колодец, прежде чем поместить пластину обратно в инкубатор. После переноса энтероидов в колодец из шестилуночной или 12-луночной пластины, каждый поочередный день заменяйте старые носители свежими носителями. И поскольку энтероиды начали процветать, проходите клетки каждые пять-семь дней.
Для иммунофлуоресцентного окрашивания добавьте 500 микролитров первичного антитела в блокирующий буфер к каждой лунке энтероидов и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. На следующий день удаляют раствор антител и трижды промывают энтероиды PBS. После инкубации в одном-400 разбавленных растворах вторичных антител с последующей инкубацией в DAPI промыть энтероиды трижды PBS.
Чтобы сохранить трехмерные структуры энтероидов, используйте вырезы из тонких силиконовых резиновых листов или стеклянных покровных слипов, чтобы создать пространство от 0,5 до одного миллиметра между нижним стеклянным слайдом и скольжением крышки. Для монтажа промыть окрашенные энтероиды 70% глицерином. Затем, используя одномикролитную инокуляторную петлю или вырезанный 200-микролитровый наконечник, поднимите энтероиды из пластины и установите с глицерином на предметное стекло микроскопа.
Приготовьте чашку Петри, покрытую прозрачной пленочной крышкой, и добавьте на пленку от двух до четырех одномикролитровой капли Декстрана-ФИТЦ. Используя микроманипулятор, введите наконечник микропипетки внутрь жидкости и над пленкой под стереомикроскопом, затем осторожно потяните шприц, чтобы вытащить Dextran-FITC в микропипетку. После заполнения микропипетки двумя-четырьмя микролитрами Dextran-FITC, нажмите шприц, чтобы удалить воздух из наконечника пипетки.
Кроме того, осмотрите колонну инжектированного материала в микропипетке, чтобы убедиться, что нет воздушного кармана, и запишите объем Dextran-FITC внутри микропипетки. Затем включите источник воздуха, подключенный к пневматическому насосу, прежде чем включать насос и устанавливать продолжительность насоса от 10 до 15 миллисекунд. Затем поверните запорный кран на шприце, чтобы открыть линию от насоса до микропипетки.
Удалите энтероиды из инкубатора и поместите тарелку на теплый пенопластовый кирпич в закрытом контейнере, чтобы свести к минимуму воздействие света после микроинъекции. Поместите чашку Петри с энтероидами под стереомикроскоп и переместите ручки микроманипулятора, чтобы поместить наконечник микропипетки под углом от 35 до 45 градусов к горизонтальной поверхности. Визуализируйте и идентифицируйте сферические энтероиды с целью введения от трех до пяти энтероидов на блюдо.
Затем продвиньте наконечник к целевому энтероиду, посмотрев через микроскоп окуляры. Затем, продвигая ручку оси Z точным медленным движением, проколите энтероид наконечником микропипетки. Продвижение должно прекратиться, как только наконечник пройдет через энтероидную поверхность, которая вдавливается и выскакивает назад.
Нажмите на педаль насоса одной ножкой и заполните энтероид зеленоватым раствором Декстран-ФИТЦ до расширения. Запишите количество насосов, чтобы рассчитать перекачиваемый объем и концентрацию декстрана. Этот протокол показал характеристику энтероидов, полученных из тканей плода, путем окрашивания различных биомаркеров, специфичных для кишечного эпителия, иммунофлуоресцентными антителами, подтверждающими их эпителиальное происхождение тонкой кишки.
Здесь показаны энтероиды на разных стадиях. Семи-10-дневный энтероид маленький и толстый. Тогда как энтероид, готовый к микроинъекции, был большим с просветом и тонкой стенкой.
Энтероид через два дня после микроинъекции все еще содержит значительное количество Декстрана-ФИТК. Проницаемость энтероидов после микроинъекции оценивали путем измерения концентрации декстрана в среде. EGTA, который, как известно, увеличивает проницаемость мембраны в плотных соединениях, использовался в качестве положительного контроля.
Анализ измерения Декстрана также показывает, что ЛПС индуцировала повышенную проницаемость, а более высокая концентрация ЛПС индуцировала более высокую проницаемость. Самое главное в фиксации и окрашивании — не нарушать форму энтероидов и не терять их во время процесса. После микроинъекции среда может быть собрана для анализа цитокинов, а энтероиды могут быть собраны для секвенирования РНК.
