Die Bedeutung dieses Protokolls besteht darin, die grobe Wahrscheinlichkeit von Enteroiden am In-vitro-Modell des vorzeitigen Epithels zu testen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die Permeabilität eines geschlossenen Lumens zu messen, das die helle Darmumgebung nachahmt. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Faktoren zu untersuchen, die eine undichte Darmerkrankung induzieren oder abschwächen.
Es kann auch auf endotheliale oder vaskuläre Systeme angewendet werden, um Bedingungen zu untersuchen, die vaskuläre Leckagen induzieren können. Dieses Protokoll erfordert etwas Übung. Wir empfehlen, jeden Abschnitt separat zu üben, bevor Sie das gesamte Verfahren zusammenstellen.
Um zu beginnen, die Darmsegmente in eine 60 mal 15 Quadratmillimeter große Petrischale mit eiskaltem Dulbecco's PBS mit Amphoteracin zu geben und 20 Minuten auf Eis einzuweichen. Mit einem Skalpell mit einer Schere schneiden Sie die Darmsegmente in drei bis fünf Millimeter große Stücke und legen Sie ein bis zwei Stücke in eine 35 mal 15 Quadratmillimeter große Petrischale mit 0,5 bis einem Milliliter Organoid-Wachstumsmedium auf Eis. Schneiden Sie den Darmschlauch in Längsrichtung mit einer Mikroschere und einer Pinzette.
Verwenden Sie dann die Pinzette, um die Epithelzellen aus der Faszie zu kratzen. Entfernen Sie die Faszie und schwenken Sie die Schale, um die Zellklumpen zu brechen. Anschließend werden die Zellen und das Medium mit einer 20-Mikroliter-Pipettenschnittspitze in einem Schritt von fünf bis 10 Mikrolitern in eine Basalmembranmatrixmischung überführt, um eine 285-Mikroliter-Lösung herzustellen.
Mischen Sie die Zellen, indem Sie in einer Basalmembranmatrix auf Eis mit einer 200-Mikroliter-Schnittspitze pipettieren. Nach dem Mischen legen Sie fünf 50-Mikroliter-Streifen der Zell-Basalmembran-Matrixmischung in eine Vertiefung einer vorgewärmten Sechs-Well-Platte, die auf einem warmen Schaumstein aufbewahrt wird. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 10 Minuten, um eine Polymerisation und eine Härtung der Basalmembranmatrix zu ermöglichen.
Sobald die Matrixstreifen verfestigt sind, geben Sie zwei Milliliter des enteroiden Wachstumsmediums in die Vertiefung, bevor Sie die Platte wieder in den Inkubator legen. Nachdem Sie die Enteroide in eine Vertiefung einer Platte mit sechs oder 12 Vertiefungen übertragen haben, ersetzen Sie jeden zweiten Tag die alten Medien durch frische Medien. Und wenn die Enteroide begonnen haben zu gedeihen, passieren Sie die Zellen alle fünf bis sieben Tage.
Für die Immunfluoreszenzfärbung fügen Sie 500 Mikroliter des primären Antikörpers im Blockierpuffer zu jeder Vertiefung von Enteroiden hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Enteroide dreimal mit PBS. Nach der Inkubation in einer bis 400 verdünnten sekundären Antikörperlösung, gefolgt von einer Inkubation in DAPI, waschen Sie die Enteroide dreimal mit PBS.
Um die dreidimensionalen Strukturen der Enteroide zu erhalten, verwenden Sie Ausschnitte aus dünnen Silikonkautschukplatten oder Glasabdeckungsgläsern, um einen Abstand von 0,5 bis einem Millimeter zwischen dem unteren Glasobjektträger und dem Deckglas zu schaffen. Für die Montage waschen Sie die gefärbten Enteroide mit 70% Glycerin. Heben Sie dann mit einer Ein-Mikroliter-Impfschlaufe oder einer geschnittenen 200-Mikroliter-Spitze die Enteroide aus der Platte und montieren Sie sie mit Glycerin auf einen Glasmikroskopobjektträger.
Bereiten Sie eine Petrischale vor, die mit einer transparenten Folienabdeckung bedeckt ist, und fügen Sie zwei bis vier Mikroliter Tropfen des Dextran-FITC auf die Folie auf. Fahren Sie mit dem Mikromanipulator die Mikropipettenspitze in die Flüssigkeit und über den Film unter einem Stereomikroskop und ziehen Sie dann vorsichtig an der Spritze, um das Dextran-FITC in die Mikropipette zu ziehen. Nachdem Sie die Mikropipette mit zwei bis vier Mikrolitern Dextran-FITC gefüllt haben, drücken Sie die Spritze, um Luft aus der Pipettenspitze zu entfernen.
Überprüfen Sie außerdem die injizierte Materialsäule in der Mikropipette, um sicherzustellen, dass keine Lufttasche vorhanden ist, und notieren Sie das Volumen von Dextran-FITC in der Mikropipette. Schalten Sie anschließend die an die pneumatische Pumpe angeschlossene Luftquelle ein, bevor Sie die Pumpe einschalten und die Pumpendauer auf 10 bis 15 Millisekunden einstellen. Drehen Sie dann den Absperrhahn auf der Spritze, um die Leitung von der Pumpe zur Mikropipette zu öffnen.
Entfernen Sie die Enteroide aus dem Inkubator und stellen Sie die Schale auf einen warmen Schaumstein in einem abgedeckten Behälter, um die Lichtexposition nach der Mikroinjektion zu minimieren. Platzieren Sie die Petrischale mit Enteroiden unter dem Stereomikroskop und bewegen Sie die Mikromanipulatorknöpfe, um die Mikropipettenspitze in einem Winkel von 35 bis 45 Grad zur horizontalen Oberfläche zu platzieren. Visualisieren und identifizieren Sie die sphärischen Enteroide mit dem Ziel, drei bis fünf Enteroide pro Schale zu injizieren.
Als nächstes schieben Sie die Spitze zu einem Zielenteroid, indem Sie durch die Mikroskopokulare schauen. Bewegen Sie dann den Z-Achsenknopf mit einer präzisen langsamen Bewegung und durchstechen Sie das Enteroid mit der Mikropipettenspitze. Der Fortschritt sollte aufhören, sobald die Spitze durch die enteroide Oberfläche geht, die drückt und zurückspringt.
Klopfen Sie mit einem Fuß auf das Pumppedal und füllen Sie das Enteroid mit der grünlichen Dextran-FITC-Lösung, bis es expandiert. Notieren Sie die Anzahl der Pumpen, um das Fördervolumen und die Dextrankonzentration zu berechnen. Dieses Protokoll zeigte die Charakterisierung von fetalen Gewebe-abgeleiteten Enteroiden durch Färbung verschiedener Biomarker, die spezifisch für das Darmepithel sind, mit immunfluoreszierenden Antikörpern, was ihren Dünndarmepithelursprung bestätigt.
Enteroide in verschiedenen Stadien werden hier gezeigt. Ein sieben bis 10 Tage altes Enteroid ist klein und dick. Während ein Enteroid, das für die Mikroinjektion bereit war, groß mit einem Lumen und einer dünnen Wand war.
Das enteroide Medikament zwei Tage nach der Mikroinjektion enthält immer noch erhebliche Mengen an Dextran-FITC. Die Permeabilität der Enteroide nach Mikroinjektion wurde durch Messung der Dextrankonzentration in den Medien beurteilt. EGTA, von dem bekannt ist, dass es die Membranpermeabilität an Tight Junctions erhöht, wurde als Positivkontrolle verwendet.
Der Dextran-Messassay zeigt weiterhin, dass LPS eine erhöhte Permeabilität induziert und eine höhere LPS-Konzentration eine höhere Permeabilität induziert. Das Wichtigste beim Fixieren und Färben ist, die Form der Enteroide nicht zu stören oder sie während des Prozesses zu verlieren. Nach der Mikroinjektion können Medien für den Zytokintest gesammelt und Enteroide für die RNA-Sequenzierung gewonnen werden.
