L’importance de ce protocole est de tester la probabilité brute d’entéroïdes sur un modèle in vitro d’épithélium prématuré. Le principal avantage de cette technique est de mesurer la perméabilité à partir d’une lumière fermée qui imite l’environnement luminal intestinal. Ce protocole peut être utilisé pour étudier les facteurs qui induisent ou atténuent la maladie intestinale perméable.
Il peut également être appliqué aux systèmes endothéliaux ou vasculaires pour étudier les conditions qui peuvent induire des fuites vasculaires. Ce protocole nécessite une certaine pratique. Nous vous recommandons de pratiquer chaque section séparément avant de mettre l’ensemble de la procédure ensemble.
Pour commencer, transférez les segments intestinaux dans une boîte de Petri de 60 par 15 millimètres carrés avec du PBS glacé de Dulbecco avec de l’amphotéracine et faites tremper pendant 20 minutes sur de la glace. À l’aide d’un scalpel avec une paire de ciseaux, couper les segments intestinaux en morceaux de trois à cinq millimètres et placer un à deux morceaux dans une boîte de Petri de 35 par 15 millimètres carrés contenant 0,5 à un millilitre de milieu de croissance organoïde sur de la glace. Couper le tube intestinal longitudinalement à l’aide de micro-ciseaux et de pinces à dissectionner.
Ensuite, utilisez la pince pour gratter les cellules épithéliales du fascia. Retirez le fascia et agitez le plat pour briser les amas cellulaires. Ensuite, à l’aide d’une pointe de coupe de pipette de 20 microlitres, transférez les cellules et le média par incrément de cinq à 10 microlitres dans un mélange de matrice membranaire basale pour obtenir une solution de 285 microlitres.
Mélanger les cellules en pipetant dans une matrice membranaire basale sur de la glace à l’aide d’une pointe de coupe de 200 microlitres. Après le mélange, placez cinq bandes de 50 microlitres du mélange de matrice membranaire basale cellulaire dans un puits d’une plaque de six puits préchauffée conservée sur une brique de mousse chaude. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 10 minutes pour permettre la polymérisation et un durcissement de la matrice membranaire basale.
Une fois les bandes matricielles solidifiées, ajoutez deux millilitres du milieu de croissance entéroïde dans le puits avant de remettre la plaque dans l’incubateur. Après avoir transféré les entéroïdes dans un puits d’une plaque de six puits ou de 12 puits, tous les deux jours, remplacez les anciens milieux par des milieux frais. Et comme les entéroïdes ont commencé à se développer, passez les cellules tous les cinq à sept jours.
Pour la coloration par immunofluorescence, ajoutez 500 microlitres de l’anticorps primaire dans le tampon de blocage à chaque puits d’entéroïdes et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps et lavez les entéroïdes trois fois avec du PBS. Après l’incubation dans une à 400 solutions d’anticorps secondaires diluées, suivie d’une incubation dans un DAPI, laver les entéroïdes trois fois avec du PBS.
Pour préserver les structures tridimensionnelles des entéroïdes, utilisez des découpes de fines feuilles de caoutchouc de silicium ou de couvercles en verre pour créer un espace de 0,5 à un millimètre entre la lame de verre inférieure et la lame de couverture. Pour le montage, lavez les entéroïdes colorés avec 70% de glycérol. Ensuite, à l’aide d’une boucle d’inoculation d’un microlitre ou d’une pointe coupée de 200 microlitres, soulevez les entéroïdes hors de la plaque et montez avec du glycérol sur une lame de microscope en verre.
Préparez une boîte de Petri recouverte d’un couvercle de film transparent et ajoutez deux à quatre gouttes d’un microlitre de Dextran-FITC sur le film. À l’aide du micromanipulateur, enfoncez l’embout de la micro-pipette à l’intérieur du liquide et au-dessus du film sous un stéréomicroscope, puis tirez doucement la seringue pour retirer le Dextran-FITC dans la micro-pipette. Après avoir rempli la micro-pipette avec deux à quatre microlitres de Dextran-FITC, poussez la seringue pour éliminer tout air de l’embout de la pipette.
Inspectez également la colonne de matériau injecté dans la micro-pipette pour vous assurer qu’il n’y a pas de poche d’air et notez le volume de Dextran-FITC à l’intérieur de la micro-pipette. Ensuite, allumez la source d’air connectée à la pompe pneumatique avant d’allumer la pompe et de régler la durée de la pompe sur 10 à 15 millisecondes. Tournez ensuite le robinet d’arrêt de la seringue pour ouvrir la conduite de la pompe à la micro-pipette.
Retirez les entéroïdes de l’incubateur et placez le plat sur une brique en mousse chaude dans un récipient couvert pour minimiser l’exposition à la lumière après la micro-injection. Placez la boîte de Petri avec entéroïdes sous le stéréomicroscope et déplacez les boutons du micromanipulateur pour placer l’extrémité de la micro-pipette à un angle de 35 à 45 degrés par rapport à la surface horizontale. Visualisez et identifiez les entéroïdes sphériques avec un objectif d’injection de trois à cinq entéroïdes par boîte.
Ensuite, avancez la pointe vers un entéroïde cible en regardant à travers les oculaires du microscope. Ensuite, en avançant le bouton de l’axe Z avec un mouvement lent précis, percez l’entéroïde avec la pointe de la micro-pipette. L’avancement devrait s’arrêter une fois que la pointe traverse la surface entéroïde, qui s’enfonce et revient.
Appuyez sur la pédale de pompe avec un pied et remplissez l’entéroïde avec la solution verdâtre Dextran-FITC jusqu’à ce qu’elle soit dilatée. Enregistrez le nombre de pompes pour calculer le volume pompé et la concentration de Dextran. Ce protocole a montré la caractérisation d’entéroïdes dérivés de tissus fœtaux en colorant divers biomarqueurs spécifiques à l’épithélium intestinal avec des anticorps immunofluorescents, confirmant leur origine épithéliale de l’intestin grêle.
Les entéroïdes à différents stades sont montrés ici. Un entéroïde âgé de sept à 10 jours est petit et épais. Alors qu’un entéroïde prêt pour la micro-injection était grand avec une lumière et une paroi mince.
L’entéroïde deux jours après la micro-injection contient encore des quantités importantes de Dextran-FITC. La perméabilité des entéroïdes après micro-injection a été évaluée en mesurant la concentration de dextrane dans le milieu. L’EGTA, connu pour augmenter la perméabilité de la membrane aux jonctions serrées, a été utilisé comme témoin positif.
Le test de mesure Dextran montre en outre que le LPS induit une perméabilité accrue et qu’une concentration plus élevée de LPS induisait une perméabilité plus élevée. La chose la plus importante à propos de la fixation et de la coloration est de ne pas perturber la forme des entéroïdes ou de les perdre pendant le processus. Après la micro-injection, des milieux peuvent être collectés pour le dosage des cytokines et des entéroïdes peuvent être récoltés pour le séquençage de l’ARN.
